siRNA表达载体的构建成功要点

1. 设计每个基因，检测两到四个siRNA序列

扫描靶基因中的AA序列，以找到潜在的靶点。记录每个AA 3端19个核苷酸作为潜在的SiRNA靶点。通过GENBANK数据库的BLAST分析，可以去除与其他基因明显相同的靶点。如果可能的话，SiRNA应该根据MRNA的低二级结构进行区域设计。

1. 选择低GC含量的SiRNA
2. 纯化体外转录SiRNA

SiRNA的大小和纯度应在转染前确认。

1. 避免RNA酶污染

微量RNA酶会导致SiRNA实验失败。由于RNA酶在实验环境中很常见，如皮肤、头发、所有徒手接触或暴露在空气中的物品，因此确保实验的每一步都不被RNA酶污染是非常重要的。

1. 健康的细胞培养物和严格的操作，以确保重复感染

一般来说，健康的细胞感染效率较高。此外，较低的代数可以确保每个实验中使用的细胞的稳定性。为优化实验，建议使用50代以下的感染细胞，否则随着时间的推移，细胞感染效率会显著降低。

1. 避免使用抗生素

抗生素应避免在细胞种植到感染后72小时内使用。抗生素会在渗透的细胞中积累毒素。一些细胞和感染试剂在SiRNA感染时需要无血清条件。在这种情况下，正常的培养基和无血清培养基可以同时进行比较实验，以获得最佳的感染效果。

1. 选择好的转染试剂转染siRNA

SiRNA实验的成功对于靶细胞类型，选择良好的转染试剂和优化操作至关重要。

1. 转染和检测条件通过适当的阳性对照进行优化

对于大多数细胞来说，看家基因是更好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照SiRNA转移到靶细胞（也适用于实验靶SiRNA），并在48小时后计算与未转染细胞相比，对照蛋白或MRNA的降低水平。过多的SiRNA会导致细胞毒性甚至死亡。

1. 非特异性影响通过阴性对照siRNA排除

适当的阴性比较可以通过扰乱活性siRNA的核苷酸顺序来设计。必须注意的是，它应该进行同源比较，以确保相对需要研究的生物的基因组没有同源性。

1. 通过标记SiRNA来优化实验

荧光标记的SiRNA可以用来分析SiRNA的稳定性和传染效率。标记的SiRNA也可以用作SiRNA的内部定位和双标记实验(配合标记抗体)来跟踪传染过程中导入SiRNA的细胞，将传染与靶蛋白表达的减少相结合。