RNA 凝胶电泳注意事项

RNA Northernn是Northern 分析RNA印记的方法 。mRNA 只占RNA的总数 的5% ，在溴化乙锭染色胶上看不到，所以MRNA 必须用标记探针进行检测。

＊样品制备

• RNA 样品必须在电泳前和电泳过程中变性，否则分子质量无法准确测量。变性由甲醛和甲酰胺完成，或乙二醛、二甲亚硫或甲基苯（不推荐）。
• MOPS 样品缓冲液： 0.75ml 0.15ml去离子甲酰胺 10 x MOPS, 0.24ml 甲醛， 0.1ml 无RNA酶去离子的水，0.1ml 甘油， 0.08ml 10% (W/V) 澳酚蓝。分装小管后储存在小管中。－ 20℃, 或者每次现配。
• 加25 μI 样品缓冲液达到5μ1 RNA 样品。可能需要浓缩RNA 样品。
• 样品缓冲液中的样品为65℃ 加热15min。加1μl mg/ml 将溴化乙锭混合到每个样品中。电泳缓冲液中不需要添加溴化乙锭。
• 中等大小的胶水，加5 ~ 20μg 总RNA, 小型胶加1~5 μg 。
• 加3 μg mRNA 与加5 ~ 20μg 总RNA 相比之下，样品会得到更清晰的信号。

＊标准参照物／标记参照物

• 需要标准参考。
• 许多人使用样品本身的核糖体RNA作为一般参考。真核生物核糖体RNA 是28S和18S （大致长5300 和2000 碱基）；核生物核糖体RNA 是23S 和16S (大肠杆菌大致长3566 与1776 个碱基） 。
• RNA 商业产品参照标准。DNA 标准参考在甲醛胶中跑得不好，不应使用。体外RNA 合成指定模板可用于确定RNA的合成长度 如果必须准确知道未知RNA的长度，可以使用转录物。
• 溴酚蓝和二甲苯腈蓝可用作指示染料。就像DNA一样 在电泳中，其确切位置取决于琼脂糖的质量和浓度(见表1) 。

表1 RNA 跟踪甲醛胶中染料迁移的跟踪

a 核苷酸的数量与染料迁移相当。

＊样式

• RNA 凝胶就像DNA 像凝胶一样电泳。不需要独立的胶盒和仪器。只需在电泳前后清洗胶盒即可。

＊缓冲液

• 10 x MOPS/EDTA 含0.2的缓冲液mol/L MOPS (3 – 林代丙磺酸吗？、50 mmol/L乙酸钠，10 mmol/ L EDTA, 调至pH7.0 。高压灭菌15min。长时间呈淡黄色是正常的。1 X 用于电泳。
• MOPS 缓冲液(和其他RNA) 缓冲液)离子强度很低。在电泳过程中，PH会沿着胶水的长度方向产生 梯度，导致胶水的水解。只有在很长的电泳过程中，缓冲液才能通过蠕动泵循环或间歇性地从一端吸入另一端来避免这个问题。

＊凝胶

• RNA 电泳必须在变性条件下进行。MOPS－甲醛胶是最安全、最好的。
• 甲醛胶必须在通风柜内倒胶，并等待固化。热甲醛会蒸发，吸入非常危险。做之前请别人指导。
• 含甲醛的琼脂糖凝胶比普通琼脂糖凝胶易碎，必须小心操作。
• 1％或者1.2 ％大多数Northernn适用于胶水 印迹。

＊电源

• 对电源的要求与DNA相同 琼脂糖凝胶。中等大小的胶水， l00V （大约50 mA) 大约3~4 小时。

＊染色

• 由于溴化乙锭已包含在样品缓冲液中，因此无需进一步染色。

＊分析

• 核糖体亚基应该是分开的。除非样品太多，否则亚基不应该区分清楚。如果不能区分，就意味着降解。
• mRNA, 若在胶水上可见，则看起来像糊状。