材料
- SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞系(药物标记的非分泌型) ATCC)
- 添加10mmol//L HEPES 和1mmol//L DMEM丙酮酸钠- 10 和DMEM-20 完全焙养基
- 免疫实验动物:小鼠、大鼠或仓鼠(第一次接种后10~14d) 备用)
- 50% （m/V) PEG 溶液，无菌
- DMEM 完全培养基，不添加血清
- 氯化铵溶液： 0. 02mol/L Tris • Cl , pH7. 2 / 0.14mol/L NH4Cl
- 添加10mmol//L HEPES 、1mmol/L 丙酮酸钠，1XHAT 或1X HT DMEM-20完全培养基
- 70% （V/V) 乙醇仅用于容器消毒
- 175cm2 用细颈瓶组织培养
- 倒置显微镜
- 400ml 和600ml 烧杯（各3 只）
- 100mm 有盖培养皿
- 尖镊和解剖剪
- 细网金属筛
- 50ml 塑料锥底离心管，无菌
- Beckman 离心机和TH-4 转子或同等设备
- 96 孔平底微量滴定板
- 1ml 和10ml 移液管
实验步骤
1. 在细胞融合前一周，开始添加HEPES DMEMEM和丙酮酸钠- 10 SP2在完全培养基中培养 /0- Ag14 骨髓瘤细胞系(融合细胞) 。对于不同的实验动物，骨髓瘤细胞在细胞融合操作前应达到以下水平(每175cm)2 培养瓶含培养液100毫升 ) ： 小鼠， 1 X 108个细胞／瓶， 2 或3 瓶；仓鼠， 2 X 108 个细胞／瓶， 3 或4 瓶；大鼠， 5 X108~1X 109个细胞／瓶， 10 瓶。
两只小鼠或仓鼠，或一只大鼠的脾脏，可以满足细胞融合的需要。
2. 前3d细胞融合 ，二次免疫。
3. 细胞融合前1d , 转移SP2/0-Ag14 将HEPES添加到新鲜骨髓瘤细胞中 DMEMEM和丙酮酸钠- 10 完全培养基。
4. SP2/0-Ag14在细胞融合前用倒置显微镜确定 骨髓瘤细胞生长良好(折射力强，无固缩)，无污染(无明显细菌或真菌迹象)，生长充足。如果骨髓瘤细胞不符合这些要求，细胞暂时不会融合。
5. 37.37.以下物品°C 预热：
3 个400ml 以及3 个600ml 烧杯，每个烧杯100毫升 水；
20ml DMEMM无菌无血清 完全培养液；
5 ml 无菌的50 % PEG 溶液。
6. 处死二次免疫实验动物。不要用麻醉法处死动物。小鼠、颈椎脱臼、二氧化碳窒息、大鼠和仓鼠， 取脾脏。
7. 将脾脏移至预置10毫升 DMEMM无菌无血清 完全培养液的100mm 培养皿中。
层流罩中超净工作台完成以下操作要求。
8. 脾组织用尖镊子压碎或解剖剪切，去除组织碎片，通过细网金属筛进一步分离细胞，制成单细胞悬液。
9. 将脾细胞悬液移至已消毒的50ml 塑料锥底离心管， 并使用无血清DMEM 用离心管填充完全培养液(不要使用含有蛋白质或HEPES) 的培养液） 。室温下， TH-4 离心机中500g 离心5min ，弃上清。
10. 在5ml 将细胞沉淀重悬在氯化溶液中裂解红细胞。在室温下静置5分钟， 加入45ml 无血清DMEM 完全培养液，如步骤9 进行离心。
11. 加入50ml 无血清DMEM 完全培养液，沉淀重悬，再次离心。重复添加DMEM 和离心一次，完成2次 次洗涤。
12. SP2/0-Ag14在洗涤脾细胞的同时 骨髓瘤细胞移入50毫升 塑料锥底离心管。步骤9 离心，分离细胞。在DMEM 中重悬细胞，如步骤11 清洗骨髓瘤细胞3 次。
13. 分别在10ml 无血清DMEM 完全培养液中的重悬脾细胞和骨髓瘤细胞。用细胞计数器和台盼蓝拒染试验测量两种细胞悬液的细胞计数和活力 。这时，两种细胞悬液都应该有100个 ％ 细胞活力。
14. 在细胞计数的基础上，约2. 5 X 106个总细胞数／ml 计算培养细胞需要添加HEPES DMEM-20，丙酮酸钠 培养基的量。37.°C 水浴预热此培养基。取96 孔平底微量滴定板标签备用，每10ml 细胞悬液需要准备一个孔板。
15. SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞和脾细胞1 : 1 (V/V) 50毫升的比例 混合塑料锥底离心管。无血清DMEM 将离心管填满完全培养液。室温下， 500g 离心5min。
16. 在离心细胞的同时，在层流罩中准备三个600毫升 烧杯(步骤5) ，内盛75 ~100ml 37°C 温水，再将3 个内盛100ml 37°C 温水的400ml 将烧杯分别放入600毫升 烧杯中， 形成水浴环境。将预热的50% PEG 无血清DMEMEM溶液试管 液体试管(步骤5)完全培养 分别放入2 个37°C 水浴中。
17. 吸收和丢弃混合细胞离心的上清部分(步骤15) ，并在第三个水浴烧杯中放置离心。使用1ml 将移液器添加到混合细胞沉淀中1ml 预热的50% PEG, 在1min 慢慢加入内匀速，每滴用移液器轻轻搅拌细胞。滴完成后，轻轻搅拌1min。
18. 用干净的移液管将预热的无血清DMEM逐渐添加到混合细胞液中 完全培养液， 同时轻轻搅拌均匀：
1min 内匀速滴加1ml DMEM;
1min 内匀速滴加1ml DMEM;
2~3min 内匀速滴加7ml DMEM （使用10ml 移液管） 。
注意， 此时应有肉眼可见的细胞团漂浮。室温下， 500g 离心5min 。
19. 在细胞离心的同时，将水浴烧杯重新加热至37°C ，并将其放入层流罩中。添加预热HEPES DMEM-10，丙酮酸钠 将培养基完全放入水浴中。
20 . 弃上清(步骤18) ，将试管放入水浴中。使用干净的10毫升 移液管将预热DMEM加入HEPES和丙酮酸钠- 10 细胞沉淀被完全培养基的力吹入。连续添加，直到所有培养基添加步骤14 准备好的培养基。若培养基体积超过50ml， 小心吸收多余量，转移到其他无菌容器中，如培养瓶。如果必要， 细胞团可以用移液管头压碎。此后，细胞悬液不需要继续保持在恒温水浴中。
21. 小心使用10毫升 移液管吸收10ml 细胞悬液(不要使用粗糙或重复的移液管)。96小心 孔平底微批滴定板的每个孔滴加2 滴(100~ 125μl) 细胞悬液。加入所有细胞悬液滴后，用干净的移液管去除过多的细胞悬液。37°C 过夜培养。
为了最大限度地减少纤维细胞的过度生长，可以添加一个可选步骤：移植到96 在孔板之前，可在培养瓶中培养完成融合的细胞悬液过夜，以去除贴壁生长的成纤维细胞。
22. 经过一天的训练，在倒置显微镜下检查细胞的生长情况。单层高活性细胞或细胞团会出现在移植适当数量细胞的孔底部。
23. 用10m l 每个孔滴加2个移液管 滴加HEPES、丙酮酸钠和HAT DMEM-20完全培养基混合物。每个孔板应更换不同的移液管头，并确保板盖不被更换，然后将孔板放置在培养箱中。
24. 如果孔板被污染， 丢弃它。或， 若污染仅限于1 或2 在个孔中，按以下步骤操作：用消毒的巴氏滴管吸收受污染的孔内容物， 移入空培养瓶。使用70％乙醇冲洗这些孔，用消霉棉签擦拭。重复清洗2 次。用蘸有70 ％用乙醇棉签擦拭周围。层流罩内有其它孔板时，不要打开受污染的孔板。
25. 于培养的第2 、3 、4 、5 、7 、9 、11 天空，用消毒的小巴氏滴管吸收每个孔的一半培养液，并将其移入空培养瓶中。操作时保持滴管45°倾斜，靠近培养上清的表面吸收。每个孔板都需要不同的滴管。添加HEPES、丙酮酸钠和HAT DMEM-20完全培养基混合物(步骤23) ，放回孵箱。如果在第2 天和第3 天空中没有发现明显的细胞死亡迹象，添加了HAT 培养液培养部分原骨髓瘤细胞，检测两者的质量。
26. 培养4d 之后，根据孔中实际细胞的数量、融合效率、杂交瘤的外观和生长情况，决定是否更换培养基。避免孔中液体变黄（酸性）并持续1d 以上。即使不需要更换培养液，也要每天检查孔板，出现酸性迹象前更换培养液。
27. 培养第14 天，改用添加HEPES 、丙酮酸钠和HT 的DMEM-20 完全培养液培养细胞，放回培养箱培养。
28 . 培养第15 直到最后，改用不添加HAT 或HT 含有HEPES DMEM-20，丙酮酸钠 完全培养液。当大多数孔内细胞生长到占孔底面积的10%~25%时 ％杂交瘤筛选可以在时间内进行。对于生长特别密集的孔，换液后可使用2d , 培养液变黄时，进行细胞筛选（ 一般情况下，小鼠－小鼠细胞或大鼠－小鼠细胞融合后10~14d， 仓鼠－小鼠细胞融合需要14~21d ) 。
如果需要筛选检测，3H-胸腺嘧啶核苷摄入试验， 至少需要更换3或4 不添加HAT 或HT 含有HEPES DMEM-20，丙酮酸钠 完全培养液，稀释残留的胸腺嘧啶核苷，以免影响后续标记。
