SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 大量制备

近年来，随着PCR的发展，PCR 以及DNA技术的出现 随着克隆和测序方法的发展，对大量质粒载体和重组子的需求也大大降低。因此，该方案曾被广泛使用，但已被更快、更简单的柱纯化方法所取代。在本方案中，通过碱裂解放大( Bimboim and Doly 1979 ) ，质粒DNA 通过含有溴化乙锭的CsCl，可以从明亮的细菌裂解物中使用 梯度离心进行纯化。

无论是高拷贝数质粒还是低拷贝数质粒，每毫升3~都可以通过这种方法获得 5μg的DNA 。由于克隆DNA，重组子的质粒通常产量较少 片段的大小和特点。

材料

试剂

琼脂糖凝胶(见步骤8 和19)

碱裂解液I<A>

• 如果用柱层分析进一步纯化制备的质粒DNA，则无菌碱裂解液Ⅰ 使用前可补充适当体积的无DNA 酶的RNA 酶( 20mg/mL, 胰RNA 酶)使最终浓度为l00μg/mL , 如果用其他方法纯化DNAA , 在此步骤中不建议添加RNA酶。

碱裂解液II<A>

• 现配现用，室温。

碱裂解液III<A>

• 用于筛选质粒的抗生素

细菌克隆转化为目的质粒

氯霉素(3 4mg/mL ) (可选；见步骤4 )

乙醇

异丙醇

溶菌酶( l0mg/mL )

限制性内切核酸酶

培养基( LB 、YT 或Te1Tificic Broth) <A> ，预热到37 °C

STE<A> ，冰浴

TE (pH8.0) <A>

设备

有盖的培养瓶( l25mL, 2L )

摇床，预设37 °C

RC6 Plus 离心机带转头，容量合适( Thermo Scientific )

分光光度计

方法

细胞制备

1. 选择转化的细菌单菌落或使用0.1 ~ 1.0mL 单菌落培养物，接种30毫升 含有适当抗生素的培养基( LB 、YT 或Terrificic Broth) 。

为保证培养物通风良好：

• 试管的体积应至少比细菌培养物大4 倍。试管盖要盖得松一些。
• 在剧烈振荡下培养培养物质。

1. 在适当的温度和摇晃速度下培养菌液，直到对数生长晚期( OD₆₀₀ 约为0.6) 。
2. 在含有500mL 的LB 、YT 或Terrificic Broth 培养液(预热到37°C) 烧瓶(2L)，适当的抗生素 中接种25mL 对数生长晚期的菌液。37 °C 剧烈振荡(300cycles/min ) ，培养2.5h 。

• 最后，菌液的OD₆₀₀ 应为0.4 。由于不同菌株的生长速度不同，最终OD可以稍微延长或缩短培养时间 值为0.4 。

1. 若质粒为低或中拷数的质粒，则在培养液中加入2.5mL 浓度为34mg/mL 氯霉素最终浓度为170μg/mL 。
2. 在37°C 300cycles/min 振荡12 ~ 16h 。
3. 取部分菌液(1) ~ 2mL) 离心管， 4°C 储存。2700g 离心15min 收集剩余的近500毫升 培养物。弃上清，倒置离心管，使残余上清流出。
4. 用200mL 冷STE 重悬细菌沉淀，按步骤6 重新收集细菌并储存-20°C 。
5. 从步骤6 中取出的1 ~ 2mL 从菌液中提取质粒， 用酶切和琼脂糖电泳分析这少量制备的质粒DNA， 确定大量培养菌液中获得的质粒是正确的。

细胞裂解

9.将步骤7 冷冻细菌在室温下放置5 ~ l0min 用18毫升解冻，用18毫升解冻 ( l0mL ) 碱裂解液I 重悬。若步骤4 氯霉素菌液用于括号中的体积数。

10.加2mL （ lmL ) 新配制的l0mg/mL 溶菌酶。

11.加40mL (20mL) 新准备的碱裂解液III 。盖上离心管盖，轻轻颠倒几次，完全混合，室温放置5 ~ 10min 。

• 延长超螺旋DNA 暴露在碱中的时间会使其不可逆转，导致环状卷曲DNA 不能限制酶切割，琼脂糖电泳的迁移率是正常的超螺旋DNA 的2 倍，很难被溴化乙锭染色。当细菌用碱裂解法提取颗粒时，可能会看到微量DNA 。

1. 加20mL ( 15mL ) 冰浴冷碱裂解液IIII 。盖上离心管盖，轻轻振荡均匀(此时不应再有两个液相)。将离心管放在冰上10min 。
2. 4 °C 用＞20 000g 离心30min， 自动停止转子，无需制动。轻轻地将上部移入量筒中，放弃沉淀。

• 不能形成紧密沉淀的原因一般是添加碱裂解液II 没有完全混合(步骤III) ) 。如果细菌碎片不能形成2万克的紧密沉淀 再离心15min， 将上清移入干净的离心管。转移时可使用4 去除粘稠基因组DNA的层纱布过滤 蛋白质沉淀。

质粒DNA 回收

1. 量取上清体积，将其与0.6相结合 将两倍体积的异丙醇移入干净的离心管中，并将其完全混合，在室温下放置l0min 。
2. 室温下12000克 离心15min 回收核酸沉淀。

• 若在4℃ 离心会沉淀盐。

1. 小心放弃上清，打开离心管盖，倒置在纸巾上清除残留物。在室温下使用70％将乙醇冲洗到管壁上，倒出乙醇，去除管壁上的液滴。将离心管开口倒入纸巾上，挥发剩余乙醇。
2. 用3mL 含有2 .0μg/mL 无DNA 酶的RNasea 的TE (pH 8.0) 溶解DNA 沉淀。轻轻振荡溶液。DNA 保存于-20°C 。
3. 质粒DNA 商业树脂可用于纯化柱层分析
4. 用DNA 结合凝胶电泳分析，测序和限制性酶切割证实了质粒结构。