碱变性法提取质粒DNA的方法

提取质粒DNA的方法有很多，包括碱变性法、羟基磷灰石柱层分析法、溴化乙锭 – 氯化锶梯度超离心法等。本实验是一种小量快速提取法。小量快速提取的方法有很多，但基本原理和步骤是一致的．包括以下步骤:(1)裂解菌体细胞；(2)质粒与染色体DNA的分离；(3)去除蛋白质。影响限制性酶活性的RNA等细胞成分；(4)去除提取过程中使用的去垢剂、盐等。

一、原理

质粒DNA采用碱变性法提取。该方法是基于染色体DNA和质粒DNA的变性预复性差异。染色体DNA的氢键在PH大于12的碱性条件下断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的氢键大部分也断裂，但超螺旋共价闭合环结构的两条互补链不会完全分离。当pH为中性时，变性质粒DNA恢复到原来的结构，并保存在溶液中。染色体DNA不能复性，形成网状结构。染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀并通过离心去除。

二、步骤

1. 选择含有PUC57质粒的大肠杆菌生长在LB固体培养基板上，连接到含有1000的大肠杆菌μg/ml氨酞青霉素（Amp）在LB液体培养基(5ml/15ml试管)中，37℃振动过夜。
2. 在微离心管中加入5ml菌液，14000r/min，离心10秒，取上清液。重复几次，收集所有细菌。
3. 倾去上清，滤纸吸干。
4. 加30μLTE缓冲液(10mmol///L Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0)，振荡菌体。
5. 加30μLTENS溶液(10mmol//L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS）,冲击10秒，直到溶液变粘。
6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3-5 S，14000r/min，沉淀细胞碎片和染色体DNA离心3分钟。
7. 上清液转移到另一个微离心管，同等体积的细胞和酚，混合均匀，12000r/min,离心2分钟。
8. 上层水相转移到另一个离心管，加2倍量冰乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9. 将乙醇倾倒，加入70％冷乙醇淋洗。
10. 倾倒乙醇，吸入滤纸，真空抽吸2～3分钟。
11. 加人50μ溶解DNA的LTE缓冲液。
12. 加入1μl核糖核酸酶(10mg)／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混合。
13. 37℃水浴30min。
14. 储存样品-20℃冰箱备用。