[实验原理]
当细胞被放置在一个非常高的电场中时，细胞膜变得透明，使外部分子扩散到细胞中，这种现象被称为电穿孔。使用这种技术，包括DNA在内的许多物质、RNA、细胞可以载入蛋白质、药物、抗体和荧光探针。电穿孔作为一种基因转导方法，已广泛应用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；此外，它还可以将各种外源物质引入活细胞作为注射方法（称为电注射）。与其它常用的外源物质导入方法相比，电穿孔具有许多优点。首先，不需要像显微镜一样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次注射数百万细胞。第二，与化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，由于电穿孔是一种物理方法，很少依赖细胞类型，因此得到了广泛的应用。事实上，对于大多数细胞类型，电穿孔基因的转移效率远高于化学方法。
高强度电场脉冲除了能使细胞膜渗透，使外界分子扩散到细胞液中外，还能引起细胞融合，称为电融合。然而，在电脉冲融合之前，细胞必须密切接触。这种电融合方法对原生质融合制备杂交植物和胚胎细胞融合制备动物克隆非常有用，特别是制备杂交瘤细胞制备单克隆抗体。几个实验室已经证明，电场电融合的效率是传统化学融合方法的10到100倍。最近，壁细胞的电融合也被用来研究细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。
[仪器、材料和试剂]
(1)仪器:
脉冲发生器、样品池：一个容器和两个平行的金属电极、二氧化碳培养箱、离心机、显微镜、微量液体移动器、镊子、剪刀、三角形瓶、吸管、毛细管、离心管等。
(二)材料:
(三)试剂:
穿孔介质（PM）：15mmol/L磷酸钾 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖(或甘露醇) 10mmol/L HEPES 将pH调整到7.3
融合介质（FM）：1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇 2mmol/L HEPES 将pH调整到7.3
[方法和步骤]
一．悬浮细胞电穿孔法：
1.电穿孔基因转移
电穿孔可用于将各种不同类型的分子输入活细胞，操作步骤非常相似。以下是基因转移为例。其他分子可以按照以下相同的步骤输入，只需更改外源DNA页面所需的分子。
1.1 使细胞在适当的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。
1.2 在穿孔介质（PM）至少洗一次。清洗细胞时，在台式离心机上离心1000rpm3分钟，使悬浮细胞沉降。然后，去除上清液，在新介质中重新悬浮细胞。
1.3 在PM中，浓缩细胞约为1000万细胞/ml。
1.4 将DNA添加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管将一定体积的细胞-DNA混合物吸入装有电极的灭菌样品池中。
1.5 输出电压和脉冲宽度设置在电穿孔装置上(脉冲宽度是指数衰减函数的时间常数，即τ=RC，C是电容，R是样品的电阻)。如果设备是CD脉冲发生器，则设置电容器和并联电阻，以实现适当的电阻τ值。
1.6 将小池放入样品池中，启动电穿孔装置，提供所需的电脉冲。
1.7 电处理后，在小池中加入1ml普通培养基，将细胞混合物从小池转移到组织培养容器（培养皿或培养孔），然后加入一些培养基，使最终培养基体积适当。然后，将样品细胞放回孵化器中，以便在正常条件下生长。
1.8 电穿孔细胞在测量转移基因表达量前培养时间不同。
2.检测电穿孔效率和细胞存活率
2.1 除罗丹明偶联葡聚糖(1mg//ml）如前所述，罗丹明偶联葡聚糖被引入目标细胞，而不是DNA。
2.2 电穿孔后，用培养基清洗细胞两次，去除细胞外的荧光葡聚糖。
2.3 电穿孔30min后，将30min添加到细胞悬液中μl台盼蓝，孵化2min，然后用培养基洗涤。
2.4 离心3min在1000rpm下收集细胞，将细胞重悬在PM中，最终体积为1000μl。
2.5 一滴细胞液(30)μl）将其放在干净的载玻片上，用盖玻片盖住，在显微镜下检测细胞，测量摄入荧光标记葡聚糖的百分比。
2.6 在明亮的视觉镜片下，死细胞可以通过染成蓝色来检测(摄取了台盼蓝)，以确定细胞存活的百分比。
2.7 在各种电场设定值下重复实验，绘制摄入葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。该曲线将显示特定细胞类型电穿孔的最佳条件。
二．悬浮生长细胞的电融合
整合悬浮细胞的步骤与电穿孔非常相似，但在高强度电场脉冲前后，细胞必须通过低、高频电场排列成链条。
1 用融合介质（FM）清洗悬浮细胞两次，然后悬挂在FM中。清洗细胞时，在台式离心机上1000rpm下离心3分钟，得到细胞沉淀，放弃上清液，将细胞悬挂在新鲜FM介质中。
2 将悬浮细胞转移到相应的融合室。如果两个不同的细胞要相互融合，则应在转移前完全混合。
3 启动介电电泳场的振幅通常小于200V/cm，频率在2MHz以内，用显微镜检测细胞是否排成链条，调节振幅和频率，达到最佳效果。
4 开启约1分钟后关闭介电电泳场，立即应用融合脉冲，振幅等级为1kV/cm。脉冲宽度小于1ms。脉冲融合后立即再次启动介电泳场，常规约2分钟。
5 关闭介电电泳池，让细胞在样品池中静置10分钟。
6 去除FM，用普通培养基再次清洗细胞。
7 在培养箱的一般条件下，将细胞转移到培养皿中，加入普通培养基进行培养。
[注意事项]
1 根据使用的特定细胞类型，最佳成分发生了显著变化。如果试图优化电压和脉冲宽度的穿孔结果仍然不令人满意，则应尝试改变穿孔介质。
2 另一个影响电穿孔/电融合的重要因素与细胞状态有关，对数生长中期的细胞必须收集才能达到最高效率。
3 纯化siRNA
感染前确认SiRNA的大小和纯度。为了获得高纯度的SiRNA，建议将玻璃纤维结合起来，洗掉或通过15-20%的丙烯酰胺胶去除反应中多余的核苷酸、小寡核苷酸、蛋白质和盐离子。注：化学合成RNA通常需要胶水电泳纯化（即PAGE胶水纯化）。
4.避免RNA酶污染
微量RNA酶会导致SiRNA实验失败。由于RNA酶在实验环境中很常见，如皮肤、头发、所有徒手接触或暴露在空气中的物品，因此确保实验的每一步都不被RNA酶污染是非常重要的。
5.健康的细胞培养物和严格的操作，以确保重复感染
一般来说，健康的细胞感染效率较高。此外，较低的代数可以确保每个实验中使用的细胞的稳定性。为优化实验，建议使用50代以下的感染细胞，否则随着时间的推移，细胞感染效率会显著降低。
6.避免使用抗生素
抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。一些细胞和转染试剂在SiRNA转染时需要无血清。在这种情况下，正常的培养基和无血清培养基可以同时进行比较实验，以获得最佳的转染效果。
7.选择合适的转染试剂
选择良好的转染试剂和优化操作对于SiRNA实验的成功至关重要，针对不同的SiRNA制备方法和靶细胞类型。
8.通过适当的阳性对照优化转染和检测条件
对于大多数细胞来说，看家基因是更好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照SiRNA转移到靶细胞（也适用于实验靶SiRNA），并在48小时后计算与未转染细胞相比，对照蛋白或MRNA的降低水平。过多的SiRNA会导致细胞毒性甚至死亡。
9通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的SiRNA可以用来分析SiRNA的稳定性和传染效率。标记的SiRNA也可以用作SiRNA的定位和双标记实验(配合标记抗体)来跟踪传染过程中导入SiRNA的细胞，并将传染与靶蛋白表达的减少相结合。
