1、Western Blot原理
Westernblot的原理是在电力场的作用下，蛋白质从大到小排列，电泳用于分离和丰富。具有抗原表位的蛋白质分子被抗体(一抗)特异性识别并结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目标蛋白。
Westernblot显色的方法主要有以下几种:(1)放射自显影，(2)底物化学发光ECL，(3)底物荧光ECF，(4)底物DAB呈色。现在常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大多数Westernblot显色底物是化学发光底物，发表文章通常使用底物化学发光ECL
2、目的蛋白信号弱或无
Westernblot发光检测中常见的问题之一是目的蛋白信号弱或无。首先，考虑转膜是否不足/转膜。如果是这样，应优化转膜条件；其次，在适当转膜的前提下，可以通过增加上样量/增加抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间来解决是否抗体-抗原敏感性过低、底物HRP或底物活性降低等问题。凝胶过厚，曝光时间短也会降低蛋白质信号，因此，要延长转膜时间和胶片曝光时间。
3、非特性条带
非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高。此外，还需要适当稀释一抗/二抗浓度。如果样品在处理过程中降解，则在样品处理过程中加入蛋白质抑制剂在冰上操作。
4、显影后膜上条带变成黄色或白色
可能是HRP过高引起的敏感性或背景过高，抗体浓度应降低。
5、条带内无显影白点
一般与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量平衡膜，注意避免胶与膜之间的气泡。显影时膜与x光片之间也应避免气泡。
6、散落在小圆斑中的存在
它是由牛奶封闭液中的杂质颗粒引起的。为了解决这些问题，封闭液可以提前4度保存。使用时不要混合，只使用上层。
7、Western Blot化学发光(ECL)淬灭的原因？
Western Blot主要有两个原因：含HRP的抗体和发光试剂。由于某种发光试剂的长期应用，人们更加关注抗体，不知道发光试剂实际上会对实验结果产生重大影响。对于抗体，“淬灭”问题可以通过适当降低抗体浓度和快速操作来解决；对于发光试剂，可以选择稳定的发光试剂来解决“淬灭”问题。
8、Western Blot背景太高
背景深是Westernn blot发光检测中最常见的问题有很多原因。首先，封闭问题。封闭条件一般为5%，牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；事实上，牛奶对大多数抗体都有很好的效果，但二抗和牛奶可能会有交叉反应，因此洗涤非常重要。此外，单一的BSA蛋白质可以减少牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深度。适当增加洗脱时间、次数和用量可以减少背景颜色。有时膜浸润不完全均匀也是原因之一。第三，条带背景深度也与曝光时间有关。背景曝光时间超过半小时是正常的，建议曝光1-10min。第四，抗体浓度过高也会导致背景过高，建议在实验前进行检测。
9、Western blot 中Tweeen-20的作用是什么？应该怎么用？
Tween-20是一种非离子表面活性剂。用于水包油乳化剂、溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂。挥发油、脂肪酸酯、醇、酮和卤化物分离分析气相色谱固定液(最高使用温度120℃)。Western 在blot的操作过程中，大部分都使用TBST洗液，而且还是封闭的，一抗二抗孵化这一关键步骤。Tween-20通常用作非离子表面活性剂、BSA的作用几乎是一样的。由于膜上结合的蛋白质会被一些去污剂所取代，所以Tween20可以用来清除封闭时的去污剂，浓度不应超过0.3%(0.05%效果最好)。如果牛奶封闭效果不好，吐温浓度可以提高。WB洗液中的吐温与BSA相同，可以保护抗原抗体蛋白。同时，由于它是表面活性剂（加入亲水环氧乙烷基团后的化合物），可以减少抗体对抗原的非特异性作用，用于洗脱未结合的抗体，减少非特异性结合。Tween-当我们使用TBST时，Tween-20的用量是0.5ml/L，不加SDS。
10、变形条带出现
凝胶有气泡或杂质，电流不稳定，凝胶冷切不均匀。保持制胶器具和电泳池清洁，更换新的电解质，确保材料无污染，并在制胶过程中去除气泡。如果电泳池老化，建议更换。尽量选择中间孔添加样品，以避免两端的样品。
