冷冻可溶性蛋白质制备是最常用的保存方法之一。将含有蛋白质溶液的试管放入机械冰箱既简单又方便。在低温下，化学降解的速度通常会降低。此外，如果冷冻本身不引起蛋白质变性，样品应稳定几周至几个月，特别是蛋白质样品应保存在-80°C 或在较低温度下。然而，由于一些压力，冷冻会导致蛋白质变性，包括：低温、溶质浓度、冰－液体界面的形成和潜在的pH值 剧烈下降。在溶液中添加冷冻保护剂可以降低降解的风险。非特异性冷冻保护机制与水溶液中添加剂的热力学稳定性相同(Heller et al. 1996) ，同一种化合物在两种情况下都是有效的。蛋白质冷冻保护剂的良好例子包括：甘油、盐析盐和二糖。剧烈冻融应激的保护程度通常与溶质的初始浓度成正比。为了获得最佳的保护，浓度通常高于0. 3 mol/L。
另一种能在冻融过程中提供保护的化合物是表面活性剂，如聚山梨醇酯和聚乙二醇，通常低至0.1% (m/V) 浓度可以达到最佳效果。认为表面活性剂与蛋白质分子竞争冰－液体界面抑制蛋白质变性(Chang et al. 1996) 。
其它蛋白质(如BSA) 合成聚合物还能抑制冷冻引起的蛋白质折叠，浓度相对较低(约为百分之几)。虽然这些化合物优先从蛋白质表面排出，但其摩尔浓度不足以通过这种机制显著改变蛋白质的化学势能。相反，在冷冻过程中，聚合物似乎通过在空间上的影响来折叠（由于大分子拥挤）来抑制蛋白质的变性。蛋白质制备物在冻融过程中对损伤的耐受性可以通过增加蛋白质的初始浓度来增强。若在给定的冻融样品中。蛋白质损伤是由蛋白质吸附引起的变性冰造成的－液体界面造成的损伤对于给定的样品体积是一定的。这样，当蛋白质的初始浓度增加时，变性蛋白分子的百分比就会下降。此外，上述讨论还可用于同一蛋白质溶液的单个蛋白质分子，以保护排阻体积效应。
要确定一个给定的溶液是否适合冷冻保存，可以先冷冻一些小块，然后第二天融化。一般情况下，如果蛋白质能承受剧烈的冻融应激，则在同一溶液中冷冻时，其保存稳定性相对较好。对于－ 80°C 和-20°C 保存，应该是首选 – 80℃。首先，较低的温度可以在很大程度上减缓降解反应；第二，在许多地方，冰箱通常无法在冰箱中达到－20℃， 特别是在门附近，在无霜冰箱中，样品会反复冻融；最后， -20°C 接近某些盐的共融点温度，温度上下循环会导致共融晶体的溶解和重新形成，从而导致蛋白质变性。
应避免反复冻融会逐渐增加样品的蛋白质变性。相反，蛋白质溶液应分为许多小部分，可根据需要取出小部分，熔化，然后使用。
磷酸钠缓冲液是研究人员在冷冻保存蛋白质时最常见的错误。二碱基盐在冷冻过程中结晶，酸盐仍保持可溶性。这样，磷酸钠在冷冻溶液中的pH值 会下降很多(比如pH 4) ，这会导致许多蛋白质变性(如Anchordoquy) and Carpenter 1996) 。pH在冷冻期间 柠檬酸盐是不太可能改变的缓冲液，Tris 和组氨酸。
