原位杂交实验流程

1.探针的设计与合成

• 根据实验室p8基因CDNA的全长序列，使用premier primer5.以卤虫CDNA为模板设计引物p81和p82，PCR扩展获得346bp产品，回收纯化。
• 克隆目的片段
  1)将连接载体的各种成分添加到无菌离心管中，载体和片段的摩尔比控制在1:3-1:8.摩尔比根据凝胶电泳检测后的浓度、载体和片段分子的大小计算。添加的成分和比例如下：
   
  2)轻轻弹动离心管，混合内容物，短暂离心。将离心管放置在PCR仪中16℃过夜连接，反应后放置在冰上。
  3)将16个固体平板表面添加到含有氨酞青霉素的固体平板上 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal（20mg/ml），均匀涂抹无菌弯头玻璃棒，避光放置在37℃培养箱1-3小时，挥发溶解X-gal的二甲基甲酰。
  4）将10 μl的连接产品加到1000 μl 在DH5a感觉细胞中，轻弹均匀，冰浴半小时，将离心管放在42℃水浴90秒，取出管后立即放在冰浴上2-3分钟，同时不要摇动离心管。在离心管中加入500 μl LB(不含抗生素)培养基37℃预热，150rpm摇床37℃振荡45分钟。目的是表达质粒上相关的抗性标记基因，恢复菌体。将菌液在4000克下离心10分钟，去除上清，加入100 μL培养液再溶，加入准备好的LB固体培养基，用无菌弯头玻璃棒轻轻均匀涂抹细胞。平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
  5)直接选择白色菌落进行PCR检测，筛选转化子。
  6)在LB液体培养基中培养转化子24小时，将1ml菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。
• 线性化重组质粒

取6 μl选择NcoI内切酶37℃酶切割4h进行测序重组质粒。酶切割反应系统为20 μl：

酶切割前后的质粒各4个 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶完全切割，用Takara胶回收试剂盒回收纯化酶切割产品，作为探针合成模板。

• 探针合成

反义RNA探针按试剂盒使用指南标记。

所有使用的试剂和器皿都经过RNase处理，合成方法如下:首先准备反应系统。以下试剂添加到RNase-Free的微离心管中:

稍加混合，短暂离心将反应液集中在管底，37℃ 2 h。反应结束后再加2 μl DNase I，37℃ 15 min，反应结束后加0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取3-5 μl 琼脂糖凝胶电泳检测反应产物1%。-20℃保存备用。

2.制备石蜡切片

◆杂交结束前必须保证RNasee-free.玻璃器皿在180℃下烘烤10小时。其他采用DEPC处理，高温灭菌锅在高温下降解DEPC。如果仪器不能在高温下处理，可以用3%的H2O2处理半小时以上，用DEPC水冲洗干燥。

• 组织的固定和包埋

选择不同发育期(0h、5h、10h、15h、20h、40h、3d、5d、7d)的卤虫，用DEPC处理水冲洗表面盐，加入4%多聚甲醛，4℃固定5-8 h，脱水、透明、包埋按以下顺序进行： 30%乙醇脱水1 h，50%乙醇脱水1 h，70%乙醇脱水1 h，乙醇脱水180%乙醇脱水 h，90%乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min，二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1):1)浸蜡30 min，54℃石蜡浸蜡1 h，包埋54℃石蜡。

• 组织切片：将包埋的组织按7分钟计算 μm厚切片，将DEPC处理水滴在多聚赖氨酸处理的载玻片上，将组织片放在42℃的展台上1小时，然后放在40℃恒温箱中12小时，然后放在4℃密封保存备用。

三、杂交前处理

二甲苯脱蜡2切片×15 min，无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，乙醇脱水50%-95%-80%-50%-30% min，后DEPC处理水2×5 min，杂交前切片处理的具体步骤如下：

• lxPBS(pH7.4)室温孵育2×5 min。
• 3%TtitonX-PBS去膜处理1500 min。
• lxpbs洗涤2×5 min。
• 无RNase蛋白酶K(20 mg/mL)37℃消化30 min。
• 100mmgly/PBS洗2×5 min。
• lxpbs洗涤2×5 min。
• 4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
• lxpbs洗涤2×5 min。
• 含有25%(W/v)乙酸酐100mm的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理15 min(现配现用)。
• lxpbs洗涤2×5 min。

4.预杂交和杂交

• 在载玻片上滴加预杂交液，然后放入湿盒中，50℃预杂交2小时。
• 放弃预杂交液，立即滴入杂交液，放入湿箱52℃杂交过夜。

五、杂交后处理

杂交结束后，不需要特别防止RNA酶。

• 废弃杂交液，将载片浸入2xsc中×15 min。
• 55℃水浴在1xSC中摇动×15 min。
• 用含20mg/ml的RNaseaNTE缓冲液37℃消化30分钟，去除未结合的探针。
• 55℃水浴在5xSC中摇动×15 min。
• 载体浸入5xSC，室温10 min。

6.抗体反应

• 使用washing buffer清洁组织片5 min。
• 滴加封闭液缓冲液室温处理组织片30 min。
• 封闭的组织片用抗体液覆盖，在湿箱中孵化3小时以上。
• Washing buffer 洗2×15 min。
• Detection buffer 中平衡2-5 min。

7.显色：在湿盒中加入显色液，黑暗静止显色16h

8.封片及观察：

• 适当显色时，使用TE buffer终止着色反应，然后用蒸馏水清洗。
• 在显微镜下观察和摄影滴加封片剂封片。