AFLP是一种DNA分子标记技术，通过限制内切酶片段的不同长度来检测DNA多态性。本AFLP 技术的主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；多态性强，分辨率高，无需 Southern 杂交；样品适用性广；遗传性稳定。在技术特点方面，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 一种结合产品。它既克服了 RFLP 复杂的技术、放射性危害和 RAPD稳定性差，标记显示隐性遗传的缺点，两者兼而有之。近年来，人们不断完善和发展这一技术，使之成为可能 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子。
一、 AFLP原理
AFLP也是一种DNA分子标记技术，通过限制内切酶片段的不同长度来检测DNA多态性。然而，AFLP首先通过PCR反应扩展酶切片段，然后在高分辨率顺序分析胶上电泳扩展酶切片段。通过不同长度的扩展片段检测到多态性。在实验中，酶切片段首先连接到含有共同粘结端的人工接头，连接后的粘结端顺序和接头顺序作为未来PCR反应的引物组合点。在实验中，根据需要在末端添加1～不同引物的三种选择性核苷，可以达到选择性扩展的目的。这些选择性核苷酸使引物能够选择性地识别具有特殊配对顺序的内切酶片段，并结合起来，导致特异性扩张。
二、实验试剂
Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ Msei接头，E A引物M C引物、T4DNALigasee和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpmark
三、操作步骤
(1)基因组DNA提取和纯化
纯化DNA:用0.8%琼脂糖凝胶(含EB0.5)μg/ml）电泳检测片段大小，取出1/3提取的基因组DNA进行纯化，首先用TE缓冲液填充至总体积50μl，再等苯酚/氯仿/异戊醇(25)：24：1）、氯仿/异戊醇(24)∶1)每抽提一次， Eppendorf管中离心吸上清液，NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇加入1/10体积，－20℃放置2h以上，10000g离心10min 70%乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，风干后溶于30μ在LTE缓冲液中，UV-A2601PC(岛津)紫外分光光度计检测、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶(含0.8%琼脂糖凝胶) EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g组织100μL溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加到300μl，此时DNA浓度约为100ng/μl。
(二)限制性酶切割和连接
在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸水补到25μl。用PCR扩增器设置37℃过夜反应后，65℃ 灭酶活20min，－保存20℃作为预扩增模板。
(三)预扩增
取3μl酶切割连接产品，加入75ng E A，75ng M C引物，15mmol//LMg2 ，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR缓冲液加双蒸水补至30μl。
反应参数为94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循环；72℃10min。反应结束后，用0.8%琼 含EB0.5.5μg/ml）电泳检测扩展产品，3μL产品稀释50倍，用作选择性扩展模板。
(4)选择性PCR扩增
稀释后的产品3μl，加入EcoRⅠ选择性引物，MseⅠ选择性引物75ng，15mmol/LMg2 ，25mmol/L dNTPs， 1UTag酶，3μl 10×PCR缓冲液加双蒸水补至30μl。
反应参数为94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循环(每循环0.7℃)；94℃30s， 56℃1min， 72℃1min，25循环；72℃5min(PEPCR仪)，首先使用0.8%琼脂糖凝胶(含EB0.5.5μg/ml）电泳检测首先选择性地扩展产品。
(5)凝胶电泳
6%变性聚丙烯酰胺胶(厚度0.5)mm）和1×TBE电泳缓冲液电泳分离。拔出梳子，140W恒功率预电泳 温度达到47分钟30分钟～49℃。尿素必须从每个孔中清洗干净。等体积上样缓冲液(98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚蓝)94℃变性5min，结束后迅速放在冰上直至点样。每条泳道加样8μl。一开始用100W恒功率电泳 2分钟后，样品迅速集中到孔底，然后调整到60W恒功率电泳，温度保持在43℃左右，从二甲苯青FF到玻璃板的2/3，结束电泳。
（六）银染
固定液：取100毫升冰醋酸至900毫升去离子水或双蒸水。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 将去离子水加入甲醛至1L。显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸钠，加去离子水至1L。
1、电泳后，将粘有凝胶的玻璃板放入用于银染的塑料板中。
2、固定：加入固定液，在摇床上轻微冲击30min。固定后，保留固定液。
3、加入去离子水漂洗3次，每次2min。
4、染色:将凝胶放入染色盘中，倒入染色液(4℃)，在摇床上轻微振动30min。用去离子水冲洗凝胶10秒后，放入显色盘中。
5、显色:添加显色液(4℃)，在摇床上轻微震荡，直到条带数量不再增加。
6、终止：加入B步后的固定液，来回漂浮几分钟。达到最佳效果后，用蒸馏水冲洗几分钟。
7、将凝胶和玻璃板上的水滴去除后，放在白光灯箱上拍照。
