DNA从细菌中分离 依赖SDS是必要的 和蛋白酶K 裂解细胞。DNA高分子质量 用酚和氯仿提取，然后用异丙醇提纯，需要剪切(以降低其粘度，更适合操作)。该方案可分为3长 0 ~ 80kb 的DNA 。
试剂
乙酸铣( 5mol/L ）
细菌培养基(≥l.5mL)
在剧烈振荡中，培养基需要过夜。
氯仿
乙醇(70%, 95%)
异丙醇
氯化钠( 5mol/L）
酚：氯仿( 1:1, V/V)
蛋白酶K （在TE 中20mg/mL , pH7.5)
核糖核酸酶A （ 在TE 中5mg/mL, pH8.0)
SDS (10%, m/ V)
TE(pH8.0) <A>
设备
可检测260nm 小杯子的波长吸收
- 小杯子可以由丙烯酸甲酯或石英制成，可以一次穿透紫外线。石英杯应在使用前后浸泡在盐酸中：甲醇（1: 1, V/V) 中， 至少浸泡3 0min , 然后用无菌水冲洗。
针管， 26G
分光光度计
携带式真空吸气器
水浴锅， 预热到37°C
方法
- 过夜培养l.5mL 细菌菌液转移到l.5mL 在微离心管中。室温下离心30s 。用真空吸气器移去上清。
- 加400μL TE(pH8.0) ，细菌沉淀用涡旋器重悬， 2 次， 每次20s 。
- 加50μL 10%SDS , 50μL 蛋白酶K （ 在TE 中20mg/mL, pH7.5 )。在37 C 孵化细菌裂解液1h 。
- 消化过的菌液很粘。使用26G 针剪切DNA， 尽量减少泡沫。
- 加500μL 1 : 1 混合酚：氯仿。
- 盖上离心管盖， 温和混合两个液相。
- 将上液相转移到新的微量离心管中， 重复步骤5 和步骤6 共2 ~ 3 第二，直到界面接触处什么都没有。
- 用500μL 氯仿提取水相。
- 将上清转移到新的微量离心管中， 加入约25μL 的5mol/LNaCl 和lmL 95 ％ 乙醇。涡旋，4°C 离心10min
- 轻轻倒出，然后用微量移液器吸出残留的乙醇。在工作台上放置离心管开口约15min 。
- 用l00μL 的TE ( pH8.0 ) 溶解干细菌沉淀，加5μL RNase A （在TE 中5mg/mL, pH8.0 ) 。在37°C 孵育30min
- 加40μL 的5mol/L 乙酸铁和250μL 异丙醇。涡旋，室温10min 。
- 室温离心10min , 收获DNA 。用70％乙醇沉淀洗涤2 二、离心管开盖在工作台上晾干约15min 。
- 用100μL 的TE （ pH8.0 ) 溶解沉淀。260nm 测DNA DNA的浓度 样本按1 : 10 稀释。空白对比是用水按1 : 10 稀释的TE ( pH8.0 ) 。1OD 260≈50mg/mL 的DNA
- 储存DNA 。
- DNA 可以在TE 缓冲液(10mol///L Tris, pH8.0 ,1mmo l/LEDTA) 储存在-20℃或4℃－20℃ 和-80 °C 储存DNA 但是DNA没有区别，但是 储存在水中容易被水解。
- DNA的长期存储 密封离心管，防止蒸发。
