限制酶特异性结合了一个特殊的DNA，被称为限制酶识别序列 井在此切割双链DNA 。它可分3 类别，分别是第一类（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
I 类和Ⅲ同一蛋白质分子中的类限制酶具有修饰(甲基化)和依赖ATP的作用 限制(切割)活动。Ⅲ类限制酶在识别位置切割DNA ，然后从底物上解离。而I 类限制酶与识别位点相结合，但随机切割并转回DNA 。I在分子克隆中 类和Ⅲ 类限制酶不常用。
Ⅱ 类限制－修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统：一种是限制性内切核酸酶（限制酶），它切割特定的核苷酸序列；另一种是独立的甲基化酶，它修改相同的识别序列。到目前为止，人们已经分离了大量的II 许多类限制酶已常规应用于分子克隆。
绝大多数II 类别限制酶识别长度为4 、5 或6 核苷酸目呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别较长的序列或简井序列。与二重对称轴相比，切割位点因酶而异：有些酶在对称轴处同时切割DNA 产生两条链．带平端的DNA 片段；另一些酶在对称轴两侧相似的位置分别切断两条链，产生带有单链突出端的DNA 片段。
通常，不同的限制酶有不同的识别序列。然而，有许多不同来源的限制酶可以切割相同的靶序列，称为同裂酶。
甲基化酶
- Dam 甲基化酶
Dam 甲基化酶可在 GATC 腺嘌呤在序列中 N6 将甲基引入位置。一些限制酶（PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ）其中包含识别位点 GATC 序列，其他酶 ClaⅠ（1/4）、 XbaⅠ（1/16）、TaqⅠ（1/16）、MboⅠ（1/16）、 HphⅠ（1/16） 这个序列包含了部分识别序列，如平均 4 个 ClaⅠ 位点（ATCGATN）有一个序列。
一些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等等。有些人对甲基化不敏感 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别点与切割点相同，但区别在于前者对甲基化敏感。
一般哺乳动物 DNA 腺嘌呤不存在 N6 上甲基化，因此对甲基化敏感的限制酶切割 DNA 不会受到影响。当需要在这些敏感点完全切割时。 DNA 时，可利用 dam- E.coli 扩增并提取 DNA 。
- Dcm 甲基化酶
Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 在第二个胞嘧啶序列中 C 的 C5 将甲基引入位置。接受 Dcm 受甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ（↓CCWGG）。在大多数情况下，同裂酶 BstNⅠ（CC↓WGG）这种影响是可以避免的，因为虽然两者的识别序列相同，但切点不同。
受甲基化酶影响的酶也有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等等。酶不受甲基化的影响。 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。
- EcoKⅠ 甲基化酶
EcoKⅠ 甲基化酶识别位点少，识别位点少 AAC（N）6GTGC 和 GCAC（N）6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但由于识别位点较少(1/8kb)，研究较少。
- SssⅠ 甲基化酶
SssⅠ 甲基化酶来自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 甲基化位置。甲基化模板可以是甲基化或半甲基化链（新合成链） DNA 链。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 限制系统。许多酶对甲基化敏感，如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等，也有不敏感的，比如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ 。
