WB发光检测中常见的问题及解决方法

免疫印迹试验（Western blot）它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的实验方法，广泛应用于蛋白质表达研究、抗体活性检测和早期疾病诊断。Westernnn比较简单，也是大家普遍接受的 blot显色法是基物化学发光法ECL，本文根据发光检测中的几个常见问题与生物人进行了探讨。疫印迹试验（Western blot）它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的实验方法，广泛应用于蛋白质表达研究、抗体活性检测和早期疾病诊断。Westernnn比较简单，也是大家普遍接受的 blot显色法是基物化学发光法ECL，本文根据发光检测中的几个常见问题与生物人进行了探讨。

众所周知，Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下由大到小排列，电泳用于分离和丰富。具有抗原表面的蛋白质分子被抗体(一抗)特异性识别并结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别与一抗相结合，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种:一、放射自显影，二、 底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈色。现在常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大多数Westernn blot显色底物是化学发光底物，发表文章通常使用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2下的氧化发光物质鲁米诺（lumino，氨基苯二酰一肼)并发光。在化学增强剂中，下光强度可增加1000倍。辣根过氧化物酶的存在可以通过在照片底片上发光标记来检测。ECL方法操作简单，应用现成试剂盒。根据说明，将两种显色底物等体积混合在膜表面，使其均匀，用玻璃胶片包裹膜，并立即在暗室内将x光片覆盖在膜上，进行显影、定影(或用荧光探测器检测)。

ECL法具有灵敏度高、线性范围广等特点。

• 目的蛋白信号弱或无。在Western blot发光检测中常见的问题之一是目标蛋白信号弱或无。首先，考虑转膜是否不足/转膜。如果是这样，应优化转膜条件；其次，在适当转膜的前提下，可以通过增加上样量/增加抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间来解决是否抗体-抗原敏感性过低、底物HRP或底物活性降低等问题。短曝光时间也会降低蛋白质信号，所以要延长胶片的曝光时间。
• 背景较高。背景深是Westernn blot发光检测中最常见的问题有很多原因。首先，封闭问题。封闭条件一般为5%，牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；事实上，牛奶对大多数抗体都有很好的效果，但二抗和牛奶可能会有交叉反应，因此洗涤非常重要。此外，单一的BSA蛋白质可以减少牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深度，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减少背景颜色。第三，条带背景深度也与曝光时间有关。背景曝光时间超过半小时是正常的，建议曝光1-10min。Westernblot由英格恩公司生产 发光试剂EnlightTM含有独特的发光增强剂和精确的发光底物，比普通发光试剂更灵敏、更稳定，发光时间长，背景更低。第四，当抗原-抗体浓度/HRP过高时，应考虑降低抗体浓度或蛋白质上样量。
• 非特异性条带。非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高。此外，还需要适当稀释一抗/二抗浓度。如果样品在处理过程中降解，则在样品处理过程中加入蛋白质抑制剂在冰上操作。
• 显影后，膜上的条带变成黄色或白色。可能是HRP过高或背景过高引起的敏感性，应降低抗体浓度。
• 条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量平衡膜，注意避免胶与膜之间的气泡，显影时避免膜与x光片之间的气泡。
• 散落在小圆点是由牛奶封闭液中的杂质颗粒引起的。为了解决这些问题，封闭液可以提前4度保存，使用时不要混合均匀，只使用上层。

Western blot发光检测中常见的问题及解决方案

底物化学发光ECL是Westernn blot最常用的显色方法之一，因此，熟悉和掌握最常见的问题和解决方案是做好westernn blot发光检测的基础。