实验方法及步骤
- 探针变性
在75℃恒温水浴中温育探针5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。
- 标本变性
- 50℃培养箱烤片2标本准备好的染色体玻片～3 h。(Giemsa染色的标本在烤片前应在固定液中提前褪色)。
- 取出玻片标本，浸泡在70～75℃体积分数70% 甲酰胺/2×SSC变性液中变性2～3 min。
- 标本的体积分数立即按顺序70%、冰乙醇系列脱水90%，100%，每次50% min，然后空气干燥。
- 杂交
DNA探针10已变性或预退火 μL 滴在变性脱水的玻片标本上，盖上18块×18盖玻片，用Parafilm密封，放在潮湿的暗箱中37℃杂交过夜(约15～17 h）。由于杂交液较少，且杂交温度较高，持续时间较长，因此为了保持标本的湿润状态，这一过程在湿箱中进行。
- 洗脱
这一步有助于去除非特异性组合的探针，从而减少底部。
- 杂交第二天，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻取下盖玻片。
- 将杂交玻片标本放置在预热42～甲酰胺/250℃的体积分数为50%×SSC洗3次，每次5次 min。
- 在已预热42～50℃的1×SSC洗3次，每次5次 min。
- 在室温下，玻璃标本为2×在SSC中轻洗。
- 取出玻片，自然干燥。
- 取200 μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片标本上，盖上玻片。
- 放大杂交信号(用于使用生物素标记的探针)
- 在玻片杂交部位加150 μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
- 去掉保鲜膜，加150 μLavidin-FITC用保鲜膜覆盖标本，37℃继续温育400 min。
- 取出标本，放入已预热的42个～在50℃的洗脱液中洗3次，每次洗5次 min。
- 在玻片标本的杂交部分加150 μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20 min。
- 去掉保鲜膜，加150 μ在标本上，Lantiavidin覆盖新的保鲜膜，37℃温育40 min。
- 取出标本，放入已预热的42个～在50℃的新洗脱液中，每次洗3次，5次 min。
- 重复前三个步骤，然后是2×清洁SSC中的室温。
- 取出玻片，自然干燥。
- 取200 μL PI/在玻片标本上加入antifade染液滴，盖上玻片。
- 封片
不同类型的密封液可以使用。如果密封液中不含Mowiol(可以使密封液自封)，可以用指甲油封闭盖子周围，以防止盖子与载体之间的溶液挥发。密封的玻璃标本可以是-20～-在70℃的冰箱里保存几个月。
- 观察FISH结果的荧光显微镜
首先在可见光源下找到细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，通过FITC标记的探针发出绿色荧光。
不同荧光材料的激发光、发射光波长和滤镜选择。
