核酸纯化可能是分子克隆最基本的操作。去除蛋白质的关键步骤通常是简单地使用酚类物质：氯仿和氯仿DNA 从水相中提取。在一步法克隆操作前，该提取物可以有效地灭活和去除蛋白酶。然而，如果DNA是从细胞裂解液等复杂分子混合物中纯化的， 需要更多的测试。在这种情况下， 一般在有机溶剂提取前使用链霉菌蛋白酶或蛋白酶K酶等蛋白质水解酶 （表1 ) 去除大部分蛋白质，这两种酶对许多天然蛋白质都有活性。
表1 蛋白质水解酶
| 母液浓度 | 储存温度 | 反应浓度 | 反应缓冲液 | 反应温度 | 预处理 | |
| 链霉菌蛋白酶a | 20mg/mL 溶于水 | -20℃ | 1mg/mL | 0.01mol/L Tris-Cl(PH7.8) 0.01mol/L EDTA 0.5%SDS | 37℃ | 自消化b |
| 蛋白酶K1 | 20mg/mL 溶于水 | -20℃ | 50μ g/mL | 0.01mol/L Tris-Cl(PH7.8) 0.005mol/L EDTA 0.5%SDS | 37- 56 ℃ | 不需要 |
- a. 链霉菌蛋白酶来自灰色链霉菌Streptomyces griseus 分离的丝氨酸和酸蛋白酶的混合物。
- b 自消化可以去除DNasee 还有RNase 污染。自消化链林菌蛋白酶可将酶粉溶解在10mmol//L Tris-Cl ( pH7.5 ) 、10mmol/LNaCl 最后，使用浓度为20mg//mL , 并在37°C 孵育1h 制备。将自消化链霉菌蛋白酶小量分装，盖上盖子，保存在-20℃。
使用酚：氯仿提取
从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用酚:氯仿(也可含0.1) ％羟基喹啉)， 然后用氯仿提取。该操作方法利用了两种不同的有机溶剂比一种有机溶剂更有效地去除蛋白质的优点。另外，酚虽然能有效地使蛋白质变性，但并不能完全抑制RNasee 活动，也有poly(A)重复RNA 分子溶剂(Brawe1man et al. 1972 )。所有这些问题都可以用酚:氯仿:异戊醇( 25 : 24 : 1 ) 避免。随后的氯仿提取物可以从制备的核酸中去除所有残留酚。
乙醚是多年前用来实现这一目标的，但目前常规DNA 不再需要或不推荐纯化。
试剂
氯仿
DNA 样品
乙醇(95%, 70%)
乙醚(可选)
苯酚：氯仿（l : 1, V/V)
盐溶液(10 mol/L 乙酸按， 8mol/L LiCl, 5mol/L NaCl, 或3mol/L 乙酸钠）
TE CpH7.8) <A> (可选；见步骤4)
设备
聚丙烯管
方法
- 将样品转移到聚丙烯管中， 加入等量苯酚： 氯仿。如果苯酚不平衡到pH7.8.8 ~ 8.0, DNA 很容易进入有机相。
- 直到乳液形式呈现出混匀管中的内容物。
- 在室温下，管道能承受的最大转速为80％离心混合物。如果有机相和水相分离不好，可以长时间离心。在正常情况下，水相在上层。但如果水相含有盐( >0 .5mol/L) 或蔗糖(>10% ），比例会变大，所以会在下层。有机相很容易识别，因为在平衡过程中加入了8-羟基喹啉，呈黄色。
- 使用移液器将上层水相转移到新鲜管道中。若体积较小(<200μL ) ，使用配有一次性吸头的自动移液器。去除中间相和有机相。为了达到最佳的回收效率，有机相和中间相可以抽取如下： 第一次提取的水相如上转移后，有机相和中间相加入等体积的TE ( pH7.8 ) 。完全混合。按步骤3 离心分离不同的相。继续第二次获得的水相与第一次获得的混合步骤5 。
- 重复步骤1 ~ 4 直到蛋白质在有机相和水相之间的中间界面中看不见。
- 添加等体积的氯仿，重复步骤2 ~ 4 。
- 用乙醇沉淀法按标准工艺回收核酸。
注意事项
分离小分子DNA 分子时(<lOkb ) 有机相和水相可以通过涡旋法混合。但是当分离中的DNA 为10 ~ 30kb 当分离大分子质量DNA时，应轻轻振荡。 ( >30kb ) 应注意以下事项，以避免DNA 被切断。
． 轻轻摇动旋转器上的管道( 20r/min ) 将有机相与水混合。
． 使用大孔移液器转移DNA 。
