一、探针标记
- 探针标记的反应系统如下：
(1)待标记探针 (1.75 pmol/μl) ：2μl
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1μl
（3）Nuclease-Free Water ：5μl
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1μl
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1μl
(6)总体积:10μl
(7)根据上述反应系统依次添加各种试剂，加入同位素后，Vortex混合均匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
- 37℃反应10分钟，使用水浴或PCR仪。
- 加入1μl 探针标记终止液，混合均匀，终止探针标记反应。
- 再加入89μl TE，混合。此时，少量探针可用于检测标记的效率。通常，标记效率超过30%，即总放射性超过30%。为了实验简单，通常不需要测量探针的标记效率。
- 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不超过3天。标记好的探针可保存在-20℃。
二、 探针的纯化
实验通常很简单，不需要纯化标记好的探针。有时，纯化探针会改善EMSA的电泳效果。如果需要纯化，可以按照以下步骤操作
- 对于100μl 标记好的探针，加入1/4体积，即25μl 的5 加入2个体积的M醋酸铵，即200μl 混合无水乙醇。
- 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
- 在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，千万不要碰沉。
- 在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸收残留液体。微干沉淀，但不宜过度干燥。
- 加入100μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不超过3天。标记好的探针可以保存 -20℃。
三、EMSA 胶的配制
- 准备倒胶模具。传统的蛋白质电泳胶模具或其他合适的模具可以用来填充。最好选择能填充薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为了获得更好的结果，您可以选择更大的灌装 EMSA 胶的模具。
- 按以下配方准备20毫升40毫升％聚丙烯酰胺凝胶(注:29:Acr/Bis等不同比例对结果影响不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1ml 重蒸水：16.2ml
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2ml
（3）80% 甘油： 625μl
（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150μl
（5）TEMED ：10μl
- 按上述顺序加入各种溶液，加入TEMED前混合均匀，加入TEMED后立即混合均匀，并立即加入胶模。避免气泡， 加上梳牙。如果发现很容易形成气泡，可以硅烷化一块制胶玻璃板。
四、EMSA结合反应
- EMSA结合反应设置如下
阴性对照反应：
（1）Nuclease-Free Water ：7μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
(3)细胞核蛋白或纯化转录因子: 0μl
(4)标记好的探针 ：1μl
（5）总体积 ：10μl
样品反应：
（1）Nuclease-Free Water ：5μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2μl
(4)标记好的探针: 1μl
(5)总体积: 10μl
探针冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
(3)细胞核蛋白或纯化转录因子: 2μl
(4)未标注的探针: 1μl
(5)标记好的探针: 1μl
（6）总体积 ：10μl
突变探针的冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2μl
(4)未标记的突变探针: 1μl
(5)标记好的探针: 1μl
（6）体积 ：10μl
Super-shift反应：
（1）Nuclease-Free Water：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
(3)细胞核蛋白或纯化的转录因子:2μl
(4)目的蛋白特异抗体 ：1μl
(5)标记好的探针:1μl
（6）总体积 ：10μl
- 按上述顺序添加各种试剂，在添加标记探头前混合，室温（20-25℃）放置10分钟，消除可能探头和蛋白质的非特异性组合，或优先考虑冷探头。然后加入标记探头，混合均匀，室温（20-25℃）放置20分钟。
- 加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混合后立即上样。注：有时溴酚蓝会影响蛋白质与DNA的结合，建造 尽量使用无色EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果使用无色上样缓冲液感觉不能上样，可以在无色上样缓冲液中加入少量蓝色上样缓冲液，观察蓝色。
五、 电泳分析
- 使用0.5XTBE作为电泳液。按10V/cm的电压预电泳10分钟。预电泳时，如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释的1X EMSA上样缓冲液(蓝色)，观察电压是否正常。
- 将混合上样缓冲液的样品添加到上样孔中。在多余的上样孔中加入10微升稀释的1XEMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)用于观察电泳的情况。
- 按照10 V/cm电压电泳。确保胶水温度不超过30℃。如果温度升高，需要适当降低电压。电泳到EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶水下缘1/4，停止电泳。
- 剪一片厚实的滤纸，大小与EMSA胶相似或略大。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸擦干胶板边缘 边缘的电压液。小心打开两块胶合板中的上一块（注：通常选择先去除硅烷化玻璃板），逐渐从EMSA胶的一侧覆盖整个EMSA胶，轻轻按压滤纸和胶。滤纸被胶水稍微浸湿后(不到1分钟)，轻轻揭开滤纸，然后EMSA胶就会被滤纸一起揭开。将滤纸向下放平，在EMSA胶上覆盖一层保鲜膜，保证膜与胶之间没有气泡。
- EMSA胶干燥在干胶仪器上。然后用x光片压片或其他适当的仪器设备进行检测。
