1、样品RNA抽提
①将裂解的细胞取冻，在室温下放置5分钟，使其完全溶解。
②两相分离 在每1mlTRIZOL试剂裂解样品中加入0.2ml氯仿，盖紧管盖。15秒后，15-30℃孵化2-3分钟。离心15分钟，4℃下12000rpm。混合液分为下层红酚氯仿相、中层和无色水相上层。所有的RNA都分布在水相中。水相上层的体积约为匀浆时添加的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到无RNA酶的干净离心管中。将异丙醇与沉淀的RNA混合，在4℃下孵化15-30℃10分钟12000rpm 离心10分钟。离心前不可见的RNA沉淀会在管底和侧壁形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 去除上清液，在每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中至少添加75%乙醇(75%乙醇使用DEPCH2O制备)，清洁RNA沉淀。4℃下7000rpm离心5分钟后，混合均匀。
⑤RNA干燥 小心吸收大部分乙醇溶液，使RNA在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入40水，无RNA酶μl用枪反复吹几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存在-80℃。
2、RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
分光光度计先用稀释的TE溶液调零。然后用TE稀释少量RNA溶液(1):100)之后，读取分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测量RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值1表示40 µg RNA/ml。RNA样品浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 µl 在DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µ在l的TE中，A260被测量 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl
取5ul测量后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：
35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②纯度检测
A260/A280的RNA溶液比值为RNA纯度，比值范围为1.8至2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测量
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10℃ ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸钠
0.01M EDTA
注入凝胶板，预留至少25个加样孔 µl溶液。凝胶后，取下梳子，将凝胶板放入电泳池，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液覆盖胶面几毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA，加入3倍体积的甲醛上样染液，加入EB到甲醛上样染液中最终浓度为10µg/ml。将样品加热至70℃孵化15分钟，使样品变性。
③电泳
上样前，凝胶必须预电泳5min，然后将样品添加到上样孔中。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂至少2h–3cm。
④在紫外线透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常明亮和厚（其大小取决于用于提取RNA的物种类型），上带的密度约为下带的两倍。它还可以观察到由低分子RNA(TRNA和5S核糖体RNA)组成的稍微扩散的带。分散的EB染色物质可以在18S和28S核糖体带之间看到，可能由MRNA和其他异形RNA组成。如果在RNA制备过程中出现DNA污染，将出现在28S核糖体RNA带上，即更高分子量的扩散迁移物质或带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的扩散。用数码相机拍下电泳结果。
3、CDNA合成样品
①反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 总体积 10μl
将溶液混合在轻弹管底部，短暂离心6000rpm。
②添加逆转录酶MMLV混合物 70℃干浴前3分钟，取出后立即将冰水浴与管内外温度一致，然后加入逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，逆转录终溶液为CDNA溶液，保存在-80℃。
4、梯度稀释的标准产品和待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-标准梯度制备actin阳性模板 阳性模板浓度为1011，反应前取3μ按10倍稀释(加水277)μl并充分混合，1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应系统如下：
标准产品反应系统
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 上游阳性模板引物F 0.5μl
3 下游阳性模板引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 DNA阳性模板 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
将溶液混合在轻弹管底部，短暂离心6000rpm。
管家基因反应系统：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 参照上游引物F 0.5μl
3 参照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 CDNA待测样品 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
将溶液混合在轻弹管底部，短暂离心6000rpm。
③准备好的阳性标准产品和检测样品同时上机，反应条件为:93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。
5、 制备DNA模板，用于绘制梯度稀释标准曲线
①对于每一个需要测量的基因，选择表达基因的CDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号 反应物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dntp混合物 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水到总体积为 25ul
将溶液混合在轻弹管底部，短暂离心6000rpm。
35个PCR循环(94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟)； 72ºC延长5分钟。
②PCR产品与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产品是否为单一特异性扩展带。
③10倍梯度稀释PCR产品： 10倍梯度稀释PCR产品： PCR产品浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6 、待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有CDNA样品分别配置实时定量 PCR反应系统。
系统配置如下：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 CDNA待测样品 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50 ul
将溶液混合在轻弹管底部，短暂离心6000rpm。
②将准备好的PCR反应溶液放入Realtime PCR扩增反应发生在PCR仪上。反应条件为:93℃2分钟预变性，然后按93℃ 一分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40个循环，最后72℃7分钟延伸。
7 、实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，遵循以下原则:引物与模板序列紧密互补；避免引物与引物之间形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的地点引起DNA 聚合反应(即错配)。
8 电泳
Realtimee的目的基因和管家基因分别进行 PCR反应。PCR产品与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产品是否为单一特异性扩增条带。
