与基因组文库不同，克隆DNA是从MRNA反转录来源的DNA。CDNA的特点是不含内含子和其他调控序列。因此，在进行CDNA克隆时，我们应该从获得MRNA开始。在此基础上，我们应该通过反向录酶产生一个补充MRNA的DNA链，然后删除MRNA，以第一个DNA链为模板复制第二个DNA链（双链）；双链进一步插入原核或真核载体。
构建CDNA文库分为六个阶段：
阶段1：CDNA第一链反转录酶催化合成
阶段2：CDNA第二链的合成
阶段3：甲基化CDNA
阶段4：连接接头或连接子
阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离CDNA
阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
