单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系

在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应建立所有候选杂交瘤。但为了减少不必要的工作量，可以选择20个 最佳候选孔。测试这20个 孔的培养上清为阳性后，这些孔的细胞应冻结，同时稀释有限。

附加材料

• 杂交瘤的生长
• 培养基的克隆和扩展
• 24 孔板
• 4ml 有盖试管，无菌

步骤

1. 当96 在孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％用无菌移液器(调整为100)汇合时(主孔)μl 微量移液器)重新悬挂主孔中的细胞，并将孔中的所有内容转移到24 孔板的孔，确保有足够的细胞在这个扩增孔中扩增。如果细胞从有成纤维细胞的孔中转移，应尽快转移，避免成纤维细胞过度生长，操作时不要刮到孔底(这样会松动成纤维细胞) 。
2. 用1ml 移液器滴入主孔3 滴添加10 mmol/L HEPES 和1mmol//L 丙酮酸钠的 DMEM-20 完全培养液，放回CO₂ 培养箱。
3. 用干净的移液器取1~1. 5ml 加入24个用于克隆和扩展的培养基 孔板， CO₂培养箱培养2~3d 。用不同的移液器从不同的试剂瓶中取出主孔和扩增孔的培养基。
4. 当24 孔板中的细胞生长到 25 %~50 ％ 汇合时(2 ~3 d ) ， 克隆操作采用有限稀释技术进行 。当主孔中的细胞长到2时 5%~50 ％如有必要，可重复步骤1~3 。
5. 有限稀释操作完成后，24 孔板中多余的细胞移入4ml 无菌覆盖试管。添加 HEPES DMEM-20，丙酮酸钠 完全培养液继续培养24 孔板中的细胞。
6. 将前述4ml 管于室温， 500g 离心5min 。保留上清进一步的抗体鉴定或对照。冷冻细胞沉淀 。如果已经确定建立了稳定的细胞克隆，那么细胞建系就完成了 ，冷冻并确保能够顺利恢复。
7. 如果有限的稀释操作不能培养具有抗体分泌活性的细胞系，那么以前从24岁开始恢复的细胞系统 孔板中分离的细胞。24 在孔板中培养，过夜，用这些细胞重建有限的稀释孔板。冷冻并妥善保存。