1. 出现无CT值
- 检测荧光信号的步骤有误： 一般SG法采用72℃延伸采集，Taqman法则一般在退火结束或延伸结束时采集信号。
- 引物或探针降解： PAGE电泳可以检测其完整性。
- 模板量不足： 未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度开始。
- 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入和反复冻融。
- CT值出现得太晚（Ct>38）
- 低扩展效率： 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；采用三步反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
- 降解或加样量不足的PCR各种反应成分。
- PCR产品太长： 产品长度一般为80-150bp。
- 标准曲线的线性关系不好
- 加样误差： 使标准产品不呈梯度。
- 标准产品降解: 标准产品应避免反复冻融，或重新制备和稀释。
- 引物或探针不良： 重新设计更好的引物和探针
- 模板中有抑制物，或模板浓度过高
- 负对照有信号
- 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
- 引物浓度差：适当降低引物浓度，注意上下游引物浓度比。
- 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
- 基因组污染模板：在RNA提取过程中避免引入基因组DNA，或通过引物设计避免非特殊扩展。
- 溶解曲线不止一条主峰
- 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
- 引物浓度差：适当降低引物浓度，注意上下游引物浓度比。
- 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
- 基因组污染模板：在RNA提取过程中避免引入基因组DNA，或通过引物设计避免非特殊扩展。
- 扩增效率低
- 部分反应试剂成分，特别是荧光染料降解。
- 反应条件不够优化：退火温度可适当降低或改为三步扩增法。
- PCR反应抑制物在反应系统中：通常在添加模板时引入，应首先引入模板
- 适度稀释，然后加入反应系统，减少抑制物的影响。
- 如何判断同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线？
判断标准：扩大效率、灵敏度、特异性
若扩增效率为90%-110%，均为特异性扩增，则可将数据用于分析。
- 扩展曲线的异常扩展？例如“S”型曲线？
- 参考染料设置不正确(MasterMix不添加参考染料时，选择NONE)
- 模板浓度过高或降解
- 降解荧光染料
