western-blot实验的影响因素一览

1. 样品质量。提取样品的蛋白质含量、蛋白质变性是否充分等，蛋白质样品的PH值是否在7~8之间。这将直接影响样品浓缩的效果。此外，蛋白质样品是否降解，目的蛋白质是否提取充分，都会影响最终结果的可靠性。
2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH值应在6.8左右，最好不要比0.5个PH单位差，因为这种PH条件是保证电泳液中甘氨酸不电离的必要条件，也是保证样品充分压缩的前提。因此，Tris-HCL缓冲液的PH值在制备凝胶时是否稳定非常重要。
3. 点样。尽量不要将样品与电泳液混合，这样可以提高浓缩效果，因为电泳液的PH值为8.3，而样品为7.5。混合后会影响样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议用长枪头或加样器轻轻将样品添加到孔的底部。
4. 电泳缓冲液。尽量新鲜准备。这样可以保证PH值和离子强度的稳定性。
5. 电压条件。我们经常使用80V浓缩，100V分离更好，条带非常平坦。
6. 转膜。膜的选择主要考虑实验的目的和要求。比如要做分子量小于20kd的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因为这可能会导致膜结合的目的蛋白质量不确定，从而影响最终结果的可靠性。如果需要对分离的蛋白质进行测序，PVDF膜是必不可少的，因为只有PVDF膜才能承受严酷的清洁条件。
7. 抗体杂交和底物显色。尽量选择小鼠或兔子来源的单克隆抗体，注意抗体是否能识别变性条件下的目标蛋白；二次抗一般效率很高，只要室温杂交1小时，适当延长也可以。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。超敏ECL发光液Enlight-Plus，检测等级可达pg级，发光时间长，稳定。