以下步骤描述了使用Cy3作为代表性标记试剂， 荧光succinimidy l 羊抗体用活性酶标记。其他水溶性荧光标记物的使用与此类似(Mujumdar et al. 1993)
- 抗体分离与纯化
来自血清、腹水或培养基的抗体应在标记反应开始前纯化，以去除含有氨基团的蛋白质和其他分子。在与标记反应混合之前，抗体不应进行强缓冲处理，否则标记混合物会减少，除抗体外，应去除所有原始和次氨基化合物。碳酸盐和硼酸盐缓冲液是最常用的。
- 染料－二甲酰胺或DMSO (0.3 – Succinimidyl活件酯(如Cy3)存储在1.0mg活性酯/100ml}中
在干燥器中，这些溶液可以储存4天，活性酯可以储存在灭菌水中， 若DMF不适用于某些抗体，则其pH为弱酸或中性时，可保存数小时， 染料水溶液可用于标记。如果反应荧光团的比例不利于整体平衡，则可以测量PBS中适当稀释的储存液，并使用染料的消光系数来确定储存液中的荧光团浓度。
- 在0. 碳酸盐1mol/L－ 碳酸氢盐缓冲液(pH9).4)抗体标记在室温15分钟内完成:0.25 ~ 1mg样Igg(6.45nmol)溶解在1ml缓冲液中， 添加200nmol/L (约0.2mg)染料不停地旋转和混合
- 通过层析渗透凝胶(0.7cmX 20cm SephadexG -50柱)，用pH7的PBS缓冲液作为洗涤液，将未结合的染料从标记蛋白中分离出来。
注意事项
- 除靶分子外， 缓冲液中不应存在原氨基成分是绝对必要的． 否则，染料主要与含氨基的成分发生反应， 而不是抗体， 例如，Tris应该避免使用
- 标记应在暗光下进行，标记产品应用锡箔包裹， 防止见光
- 若反应中使用的抗体量过小， 从凝胶过滤柱中很难获得令人满意的标记产量，微柱可以用塑料枪头制作
- 假如染料放置时间过长， 或长期暴露在高湿度环境下． 失去反应的可能性： 逆相TLC可以通过在甲醇或乙醇中标记有机胺来检查反应活性来确认标记的胺的存在
- 当标记试剂与抗体分子结合时， 显示明显的光谱变化． 例如，F/P值需要更准确地测量， 当染料二聚体和单体具有不同的吸收峰值和消光系数时， 此时需要这种方法：在这种情况下， 标记的蛋白质溶解在甲酰胺中，有利于光谱的吸收， 单独测定染料的消光系数进行计算。
