原位PCR
在科学研究中，每一项新技术的建立都会带来一系列新的研究成果，从而促进各学科的发展。纵观形态研究领域，20世纪50年代电子显微镜引入形态观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；20世纪60年代至70年代，免疫组织化学和免疫细胞化学技术的广泛应用将观察水平从亚细胞结构推向蛋白质分子水平，使细胞中的许多活性物质能够定位细胞或亚细胞水平，这无疑对医学生物学的发展产生了深远的影响。20世纪70年代，分子生物技术在形态学中得到了广泛的应用。随着原位杂交技术的出现，可以定位组织细胞中特定的DNA或RNA序列，将蛋白质水平提高到核酸分子的观察和定位，从而加深人类对基因水平中许多生命现象的理解；20世纪80年代，PCR-多聚酶链反应技术出现在分子生物学领域，它很快被引入形态学观察领域，以定位和观察细胞中低复制或单复制的特定DNA或RNA。这一技术的出现，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又迈出一大步。这一技术的出现，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又迈出一大步。
1、基本原理
原位PCR技术的基本原理是将PCR技术的高效扩展与原位杂交的细胞定位相结合，从而检测组织细胞原位单副本或低副本的特定DNA或RNA序列。
PCR技术是在DNA聚合酶的作用下，通过模板变性、退火和引物延伸三个循环，在引物引导下快速扩展特异性靶序列，通过扩展靶序列（通常可扩展10）6倍)，在凝胶电泳或Southern印记杂交中很容易显示。因此，PCR技术具有灵敏度高、特异性强的优点。随着热循环自动化的改进和稳定性，PCR技术的操作简单易行。然而，PCR技术是在液相中进行的。在扩展之前，需要将细胞损伤并提取核酸作为模板。因此，很难将PCR的结果与组织细胞的形态结构联系起来。同时，也很难判断具有特定靶序列的细胞类型。
原位PCR技术成功地将PCR技术与原位杂交技术相结合，既保持了两种技术的优势，又弥补了各自的不足。为了保持组织细胞良好的形态结构，原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定。细胞膜和核膜具有一定的渗透性。当PCR扩展时，各种成分，如引物、DNA聚合酶、核苷酸等，可以进入细胞或细胞核，以固定在细胞或细胞核中的RNA或DNA为模板，并在原位扩展。扩展的产物一般分子较大，或相互交织，不易通过细胞膜或在膜内外扩散，从而保持在原位。这样，原细胞内单复制或低复制的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极度扩展，原位杂交技术很容易检查扩展产物。
2 基本类型
根据扩增反应中使用的三磷酸核苷原料或引物是否标记，原位PCR技术可分为直接法和间接法。此外，还有反转录原位PCR技术。
2.1PCR技术直接在法律原位
直接法原位PCR技术是将扩展产品直接携带标记分子，即使用标记的三磷酸腺苷或引物片段。当标本扩展PCR时，标记分子与扩展产品混合，显示标记，可以在标本（原位）中显示特定的DNA或RNA。
常用的标记物包括放射性同位素35S、生物素和地高辛，标记物的位置通过放射性自显影或亲和组织化学和免疫组织化学来显示。
PCR技术具有操作简单、工艺短、省时等优点。缺点是特异性差，容易出现假阳性，扩增效率低，尤其是石蜡切片。因为在生产过程中，无论是固定、脱水还是包埋，都会对DNA造成损坏，而受损的DNA可以通过反应系统中的标记三磷酸核苷进行修复，使标记混入DNA的非靶序列，造成假阳性。如果采用标记引物的方法直接原位PCR，其扩展效率低于非标记。
2.2 PCR技术间接法原位
间接法原位PCR技术是目前应用最广泛的原位PCR技术，首先在细胞中扩展特定的DNA或RNA，然后使用标记探针进行原位杂交。
与直接法不同，间接法原位PCR的反应系统与传统PCR相同，所用引物或三磷酸腺苷均无标记物。也就是说，实现先扩展的目的，然后使用原位杂交技术检测细胞内扩展的特定DNA产品。因此，它实际上是一种将PCR技术与原位杂交技术相结合的新技术，因此也被称为PCR原位杂交(PCR in situ hybridization , PISH)。
间接法PCR技术具有特异性高、扩增效率高等优点。缺点是操作步骤比直接法复杂。
2.3 原位反转录PCR技术
原位反转录PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)它是将液相RT-PCR技术应用于组织细胞标本中的一种新技术-PCR(液相)的区别在于，在原位反转录PCR反应之前，组织标本应先用DNA酶处理，以破坏组织中的DNA酶，这样，扩展模板就是从MRNA反转录合成的CDNA，而不是细胞中的原始DNA。其它基本步骤类似于液相RT-PCR。
3 基本步骤
原位PCR技术的基本步骤包括标本的制备。原位扩展（PCR）以及原位检测等基本环节，现分为以下几个方面(以石蜡切片为例)。
3.1 标本的制备
原位PCR技术可用于细胞悬液、细胞涂片、冰冻切片和石蜡切片。相比之下，以悬浮完整细胞为原位的PCR效果最好，石蜡切片效果最差。随着一些技术问题的解决，近年来也有报道称，石蜡切片的PCR效率令人满意。效果差的原因有很多，比如玻璃上的PCR导热性差，热对流不均匀，TaqDNA酶被玻璃吸附等。更重要的原因可能是标本制作后细胞缺乏完整的细胞浆或核膜，膨胀产品容易扩散，导致膨胀产品原位难以保留。绝大多数病理标本以福尔马林固定和石蜡包埋的形式保存。如果石蜡切片原位PCR的相关技术问题能够很好地解决，显然具有重要意义。
固定组织细胞 一般认为组织细胞在固定10%缓冲福尔马林或4%多聚甲醛后进行原位PCR效果较好。固定时间一般不宜过长，根据组织大小，一般为4℃4-6小时。
切片的厚度 一般来说，如果切片较厚，原位PCR效果较好，因为切片越厚，靶DNA含量越多，膜结构越多，防止扩张产物扩散的效果越明显。但厚切片细胞重叠较多，形态观察效果较差，分辨率也会下降。
玻片的处理 为防止石蜡片在PCR和原位杂交过程中脱落，玻璃片应防止脱落。常用的方法是涂多聚赖氨酸或硅烷化，一般可以防止组织脱落。
蛋白酶的消化作用 组织标本在原位扩展前需要蛋白酶处理。蛋白酶消化的组织细胞可以增加其渗透性，充分允许反应系统中的成分进入细胞，并暴露靶序列，有利于扩展。常用的蛋白酶包括蛋白酶K、胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶的消化程度应根据组织固定程度进行调整。蛋白酶消化后，注意加热灭活酶的活性或通过充分清洗完全去除酶，因为只要有少量残留酶，就会对随后PCR反应系统的TaqDNA酶数量产生毁灭性的影响。
蛋白酶消化处理组织细胞可以提高渗透性，有利于后续反应成分进入细胞或核心，但也增加了扩散产物的扩散机会，可能带来假阳性或假阴性的结果。
原位扩增（PCR）
在组织细胞标本上进行PCR反应，其基本原理与液相PCR完全相同。
引物 PCR使用的引物一般为15-30bp，扩展片段约为100-1000bp。原位PCR应使用较短的引物。从石蜡切片中提取的DNA很少超过400bp，RNA很少超过200bp。长序列扩展容易导致引物与模板错配，导致非特异性反应。
反应体系 原位PCR的反应系统与传统的液相PCR基本相同。为了获得更好的扩展效果，有些人提倡反应系统中的引物、TaqDNA聚合酶和Mg2 PCR反应系统的浓度应高于液相。在反应系统中添加牛血清白蛋白（BSA）,为了防止TaqDNA聚合酶与玻片的结合，降低扩展效率。
热循环 原位PCR的热循环可在专用热循环仪上进行，操作简单。它也可以在一般的PCR热循环仪上进行。通常，在样品平台上覆盖一层铝箔，制作平台。样品平台上的空间用矿物油或水填充。热循环步骤可以在平台上携带玻璃。
为了保证充分扩展，原位PCR热循环中的每一步都可以比传统PCR略长。此外，还可以使用热启动（hot start）当玻片加热到80-94℃时，立即加入TaqDNA聚合酶。
为了保证反应系统在热循环过程中不会丢失太多，盖子周围可以用清亮的指甲油、矿物油或PAP笔封闭。
洗涤 原位扩展后，应清理标本，以去除扩散到细胞外的扩展产物。清洗不足会导致检测过程中出现扩展产物，导致背景过深或假阳性结果。然而，过度清洗也会导致细胞中扩展的产物被冲走，这是阳性信号减弱或丢失的。
一些作者在扩展后用4%多聚甲醛2小时或2%戊二醛5分钟固定，使扩展产品在检测过程中能够很好地保留在细胞内，提高检测的敏感性和特异性。
原位检测 原位PCR扩展产品的检测方法取决于原位PCR的设计方案。根据标记分子的性质，直接对扩展产品进行原位检测。间接规则需要通过原位杂交进行检测。
4 原位PCR技术的应用
原位PCR技术的突出优点是可以在组织细胞原位检测到复制量较低的特异性基因序列。根据待测基因的性质，原位PCR的应用可分为外源性基因检测和内源性基因检测。
4.1用于检测外源性基因
4.1.检测病毒基因
感染病毒的细胞往往没有更好的检测方法，但当原位PCR技术应用时，这个极其困难的问题有望得到解决。
对HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等病毒的检测使我们能够成功地观察这些病毒在艾滋病、生殖系统肿瘤、肝炎和肝癌中的作用，并及时发现感染者。
4.1.2.检测细菌基因
最突出的应用是检测结核杆菌。当结核病变不够典型时，镜下很难通过特殊染色方法找到结核杆菌。原位PCR技术的应用有助于明确诊断。当结核杆菌很少时，它们仍然很容易在镜下找到。
4.1.检测导入基因
在转基因动物的研究中，原位PCR技术可以证实基因是否被引入，基因是否被引入，基因是否被引入。因此，原位PCR技术已成为一种重要的检测手段。
4.2 用于检测内源性基因
4.2.检测异常基因
原位PCR技术还可以检测体内基因的突变、重排、原癌基因、抑癌基因的突变、恶性淋巴瘤免疫球蛋白重链基因的重排，为肿瘤的研究和诊断提供了广阔的应用前景。
4.2.2.检测固有基因
对于机体细胞中只有单个或几个副本的低表达固有基因，原位杂交技术由于基因副本太少，液相PCR可以扩展检测，但不能确定细胞类型的基因，原位PCR技术弥补了上述两种技术的不足，使我们能够检测各种人类基因，完成人类基因图的绘制。
