外源性长链DSRNA或表达长反向重复RNA在植物及大多数真菌、非哺乳动物及其细胞系中的应用 转录能诱发细胞内相应的MRNA 的降解(Fire et al 1998; Kennerdell and Carthew 1998; Misquitta and Paterson 1999) 。哺乳动物卵母细胞和DSRNA 哺乳动物细胞系诱导干扰素反应不足，长链DSRNA 反向重复RNA 转录也能诱发RNA 干扰。dsRNA 干扰素反应是一种自然免疫反应。长度超过30bp dsrna 能够激活2 ‘, 5’－寡腺前酸合成酶和蛋白激酶R , 它能激活RNasee L 并使真核起始因子2 的α亚基(EIF2) -α） 失活(Minks et al. 1979; Manche et al. 199 2) 。干扰素反应诱导MRNA 非特异性降解，广泛抑制蛋白质合成，最终诱发细胞凋亡。因此，不再可能使用长链DSRNA来抑制特定基因的研究。
长链DSRNA 的设计
一般来讲， 500~800bp DSRNA的长度 分子可用于靶向外显子，特别是编码序列(CDS ) (Hannon 2003) 。据报道，如果目标MRNA 另一个mRNA 同源序列长度超过19bp ,目标MRNA 有效抑制表达(Kulkarni et al. 2006) 。因此，使用dscheck 、E-RNAi 、BLAST 或者类似的计算方法寻找DSRNA 该技术的重点是有义链或反义链与细胞内MRNA的同源性。此外，我们还应该注意针对同一个MRNA dsrna RNA是由其他区域引起的 干扰效应。
表1 dsRNA 还有sirNA 设计工具
长链DSRNA 的体外合成
RNA利用来自噬菌体的RNA 聚合酶如T7 、SP6 和T3 体外合成是RNA的制备 长链DSRNA干扰实验 一种简单快捷的方法 。应用体外转录反应制备单独的有义链或反义链也是推荐的方法，特别是在制备富含GC的时候 dsrna 时。在复性有义链和反义链之前，这种方法的应用可以分别评估其质量。此外，正义模板和反义模板可以混合在一个体外转录系统中，也可以使用两个反向RNA dsRNA的方法是用聚合酶启动子转录同一个模板 。
- 质粒模板。制备质粒模板的方法有两种。一种方法是选择DSRNA，将DNA对应于其有义链或反义链 带有噬菌体RNA的片段克隆 聚合酶启动子质粒的多克隆位点。另一种方法是:DNA 片段克隆至质粒，使其位于一对反向噬菌体RNA 在聚合酶启动子的中间。在这两种方法中，在体外转录之前，需要在插入片段的两端使用限制性内切核酸酶插入DNA 为了保证相应的转录物RNA线性化 的长度。
- PCR 模板。T7 、SP6 或T3 只有19bp，噬菌体启动子长度较小， 这使得它们能够连接到正向或反向PCR 引物的5 端。通过PCR，可以使用连接起动子的正向引物和未连接起动子的反向引物 反应正义或反义模板的体外转录扩展 。也可以使用一对集成了启动子的PCR 同时，引物扩大同一模板。RNA从体外转录 得率来看， PCR 模板优于质粒模板，因为前者可以在不增加反应系统的情况下进行DNA 模板的摩尔浓度在清除总量的情况下增加。
dsrna反向重复 的内源性
为了进行体内应用，可以构建表达长链发夹RNA 表达方式是组装正义和反义序列，并利用间隔区将其分开，以产生反向重复序列（ Lee and Carthew 2003 ) 。克隆反向重复序列具有挑战性，但使用含子作为间隔区可以提高细菌中构建体的稳定性，使克隆更容易实现。长链发夹DSRNA RNAA的内源性表达可以通过 聚合酶II 启动子(如CMV) 或者二元表达系统（ 如GAL4/UAS ) 在特定细胞系或转基因动物体内引起待续、诱导和组织特异性的基因沉默。这种方法的主要缺点是反向重复序列的构建耗时。
