western-blot的实验步骤

Western，也叫Western blot、Western blotting、Western印记是用抗体检测蛋白质的重要方法之一。可按以下步骤操作。
1.收集蛋白质样品(Protein sample preparation)
用细胞裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。然后测量每个蛋白质样品的蛋白质浓度。
2. 电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶(分离胶和浓缩胶)可以参考一些文献资料准备

(2) 样品处理

   在收集的蛋白质样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如，2X或5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减少上样体积，在相同体积的上样孔中可以上样更多的蛋白质样品。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可参考相关文献资料准备， 加热100℃或沸水浴3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3) 上样与电泳
(1)冷却至室温后，将蛋白质样品直接取样至SDS-PAGE胶加样孔。 最好使用预染蛋白质分子量标准，以便于观察电泳效果和转膜效果，判断蛋白质分子量。
(2)电泳时，通常建议在上胶时使用低压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下胶时使用高压恒压电泳。Bio-Rad标准电泳装置 或类似于电泳装置，低压可设置在80-100V，高压可设置在120V左右。
(3)为了方便电泳，也可以采用整个SDS-PAGE过程的恒压，通常设置电压 100V，然后设定900V的时间－120分钟。设置时可避免频繁的电泳过头。通常，当溴酚蓝到达胶水的底部时，可以停止电泳，或者根据预染蛋白分子量标准的电泳，预计目的蛋白已经适当了 电泳可以在分离后停止。

3. 转膜(Transfer)
(1)我们建议在Western实验中选择PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜相对脆弱，在操作过程中容易开裂，尤其是用镊子夹住。请参考制造商推荐的使用步骤。一般情况下，如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可将转膜电流设置为300-400ma，转膜时间为30-60分钟。也可在15-20ma转膜过夜。具体的转膜时间取决于目的蛋白的大小，目的蛋白的分子量越大， 转膜时间越长，目的蛋白分子量越小，转膜时间越短。

(2)转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会出现非常严重的发热现象，最好将转膜槽放在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以观察预染蛋白分子量标准，通常分子量最大的1-2条带很难转移到膜上。转膜效果也可用于丽春 为了观察转膜的实际效果，红染液染色膜。SDS-PAGE胶也可以用考马斯亮蓝快速染色液染色，观察蛋白质残留。

4. 封闭(Blocking)

（1）膜转移后，立即将蛋白膜放入准备好的网格洗涤液中，漂洗1-2分钟，以清洗膜上的膜转移液。从膜转移后的所有步骤来看，我们必须注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则很容易产生更高的背景。

(2)用微型台式真空泵吸收洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上慢慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以使用 4℃ 封闭过夜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

(1)参考一抗说明书，用Western一抗稀释液按适当比例稀释一抗。

(2)用微型台式真空泵吸收封闭液，立即加入稀释的抗性，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇晃孵化一小时。如果抗孵化一小时 如果不好，可以在4℃慢慢摇晃孵化过夜。

(3)回收抗性。加入Western洗涤液，在侧摇床上慢慢摇动洗涤5-10分钟。吸收洗涤液后，加入洗涤液，洗涤5-10分钟。一共洗三次。如果结果背景高，可以适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

（1） 参照二抗说明书，用Western二抗稀释液按适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。

(2)用微型台式真空泵吸出洗涤液，立即加入稀释的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇晃孵化一小时。

(3)回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摇床上慢慢摇动洗涤5-10分钟。吸收洗涤液后，加入洗涤液，洗涤5-10分钟。一起洗 三次。若结果背景较高，可适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)

（1） 参照相关说明书，超敏ECL发光液如英格恩Enlight可用于检测蛋白质。
(2)洗片时可使用x光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影试剂盒自行准备显影液和定影液进行手动洗片。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白质样品很有价值，可以用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，重复使用蛋白膜