western-blot实验心得

       我做WB已经很久了，最大的困难之一就是样品制备！有时候你无法想象蛋白质的降解，可能出奇的糟糕，也可能一点都没有~~如果单独做WB，感觉“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则更有效。尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading。 buffer裂解，然后取出部分蛋白质定量，其余加入loading buffer100度完全变性，然后分装保存。有时比蛋白酶抑制剂更有效。

      另一种感觉是，样品中目的蛋白的量仅限于WB检测的下限。一般目的蛋白的量不应低于1ng（尽管ECL法的下限为0.1ng，也就是100pg)，最好在10ng以上。这就要求在做WB之前，我们必须充分考虑目标蛋白的可能丰度。最好做好充分的准备，然后设计细胞量或组织量。不要稀释样品，否则很难做到。

      另一个是显影液的选择。如果选择不合适的显影液，会造成背景高、灵敏度差、易淬灭、发光时间短等问题。建议选择合适的显影液。我用的是ECL发光液Enlight-plus，超级灵敏，发光时间长，最后的图像很清晰。

      最后，多看文献，最好看看别人在做蛋白质之前是怎么做的，有什么特殊要求，如何选择内参等等。