聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)它是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩张技术。具有特殊、敏感、产量高、速度快、简单、重复性好、自动化方便等突出优点。
一、 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)
PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成：
① 模板DNA变性:模板DNA加热到93℃左右一段时间后，解离模板DNA双链或PCR扩展形成的双链DNA，使其与引物结合，为下一轮反应做准备；
② 退火(复性)模板DNA和引物：加热变性成单链后，模板DNA的温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列相结合；
③ 引物的延伸:DNA模板–在TaqDNA聚合酶的作用下，引物结合物以DNTP为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保留复制原理合成新的模板DNA 半保留复制链的互补链。
④ 重复循环变性–退火–延伸三个过程可以获得更多的“半保留复制链”，这个新链可以成为下一个循环的模板。
每完成一个循环需要2～4分钟，2～3小时可以扩大数百万倍的基因。到达平台期(Plateau)所需的循环次数取决于样品中模板的复制。反复进行PCR反应动力学PCR的三个反应步骤，使DNA扩增呈指数上升。最终DNA的反应 Y=(1)可用于扩增 X)n计算。Y代表DNA片段扩展后的复制数，X代表平面(Y)每次扩展效率，n代表循环次数。平均扩展效率的理论值为100%，但在实际反应中，平均效率不能达到理论值。
在反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式。随着PCR产品的逐渐积累，扩展的DNA片段不再呈指数增长，而是进入线性增长期或静止期，即“停滞效应”，称为平台期数、PCR扩展效率、DNA聚合酶PCR类型和活性以及非特异性产品的竞争。
PCR扩增产品可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格限制在两个引物链5端之间，是需要扩展的特定片段。由于引物组合的模板不同，形成了短产物片段和长产物片段。以原始模板为例，在第一个反应周期中，引物从3端延伸，5端固定，3端没有固定止点，长度不同，即“长产物片段”。进入第二个周期后，引物除了与原始模板相结合外，还与新合成的链(即“长产品片段”)相结合。当引物与新链相结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这意味着延伸的片段3端是固定的，以确保新片段的起点和止点仅限于引物扩展序列内的“短产物片段”，并形成一致的长度。不难看出，“短产物片段”是按指数倍数增加的，而“长产物片段”是按算术倍数增加的，几乎可以忽略不计，这使得PCR反应产物可以保证足够的纯DNA片段用于分析和检测，而无需再纯化。
试剂
结合特定DNA模板的引物、去离子水、商业化DNA聚合酶和缓冲液DNA模板，dNTP, MgSO4(可选)和DMSO(可选)
PCR反应开始前的准备工作
在PCR反应开始之前，您需要准备DNA模板（基因组DNA或反向录制的CDNA）、特定引物（手动设计或软件设计），并选择合适的商业DNA聚合酶（根据实验目的做出决定）。
1. 选择DNA聚合酶。市场上有多种DNA聚合酶可供选择，其特点也各不相同。所以你需要选择最适合你实验需要的产品。DNA聚合酶通常分为高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。若要获得无任何突变的PCR产品，则应选用高保真聚合酶。如果你只是想判断特异性序列是否存在，普通的Taq聚合酶就足够了。另外需要注意的是，在连接T载体时，需要知道高保真聚合酶获得的产品没有A端，所以在连接T载体之前需要添加A反应。或者直接选择普通的Taq聚合酶。
2. 引物。引物的特异性会影响PCR反应成功的可能性，良好的引物设计对PCR成功至关重要。在设计引物时，应仔细考虑以下原则：
1. 引物长度。PCR引物的长度通常在18-22个碱基之间。这足以满足引物的特异性和退火温度。
2. 解链温度TM。TM值的定义是使一半的双链DNA解螺旋成为单链DNA的温度。引物的TM值通常在52-58度之间。
3. GC含量。最合适的GC含量为40-60%。
目前很多软件都可以用来设计引物，比如primer5和oligo。通常这些软件设计的引物都能满足需求。
步骤
PCR实验可以通过准备各种试剂和PCR仪器来开始：将各种试剂混合，并根据说明书设置PCR反应。一般PCR循环如下：
1. 启动步骤：热启动PCR必须将反应混合物加热到94-98度，以激活DNA聚合物酶。此步骤取决于所选DNA聚合物酶。
2. 变性步骤：DNA本身是一个双链结构，DNA扩展需要引物与单链DNA模板相结合。在这一步中，反应混合物被加热到94-98度，保持20-30秒，以破坏双链之间的氢键，释放单链DNA。这是PCR循环的第一步。
3. 退火步骤：变性后，DNA模板以单链的形式存在于反应混合物中。由于引物在反应系统中与DNA模板互补，当反应温度降至50-65度时，引物与互补序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的TM值，通常低于引物的TM值3-5度。这一步通常持续20-40秒，DNA合成将聚合酶结合到引物-模板双链中。
4. 延伸步骤：在这一步中，DNA聚合酶开始DNA合成，因此这一步的温度选择DNA聚合酶的最佳温度。我们通常选择72度，但一些DNA聚合酶的最佳温度是68度。这一步类似于体内的DNA复制:DNA聚合酶将DNTPS添加到引物的3端，最终获得新的DNA双链片段。延伸时间取决于目的DNA片段的长度和DNA聚合酶的合成能力。一般来说，DNA聚合酶每60秒就能合成1kb长度的DNA。
5. 第二步到第四步称为循环：每次循环后DNA的数量是前一次的两倍。PCR反应通常进行30-35个循环。在前几轮PCR循环中，PCR产品的数量以指数速率增加，但在反应后期，随着DNTPS和引物的减少和DNA聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此PCR反应的产量也有限。
6. 最后的延伸步骤：当30-35个循环结束时，我们通常以68-74度延长5-10分钟，希望完成反应系统中残留的所有单链DNA。
7. 维护时间:反应后PCR产品的保存温度通常设置为4-10度。
二、总结PCR常见问题
1. 无扩增条带
(1)酶失活或在反应系统中未添加酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，通常通过更换新酶或使用另一种来源酶来获得令人满意的结果。
(2)模板中含有杂质。特别是甲醛固定和石蜡包埋的组织通常含有甲酸，导致DNA脱嘌呤，影响PCR。
(3)变性温度是否准确:PCR仪表示温度是否与实际温度一致，过高酶在前几个循环中迅速失活；如果过低，模板变性不彻底。
(4)蛋白酶和核酸酶被污染在反应系统中，反应系统应在95℃加热5-10分钟，才能添加Taq酶。
(5)引物变质失效。合成引物是否正确。由于储存条件不当，是否纯化或失活。
(6)引物错误。用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(7)DNA凝胶电泳时加阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
2. PCR产品量过少
（1） 退火温度不合适。梯度PCR反应以2度为梯度，优化退火温度。
（2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3） PCR循环不足。增加反应循环数。
（4） 引物量不足。增加系统中引物的含量。
（5） 延伸时间太短。延伸时间设置为1kb/分钟。
（6） 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
（7） 抑制剂存在于DNA模板中。确保DNA模板清洁
3. 扩展产品在凝胶中涂布或片状条带扩散
(1)酶量过高。减少酶量；酶质量差，替代另一个来源的酶。
(2)DNTP浓度过高。降低DNTP浓度。
(3)Mgcl2浓度过高。可适当减少其用量。
(4)模板量过大。质粒DNA的用量应该是<基因组DNA应为50ng<200ng。
(5)引物浓度不够优化。重复PCR对引物进行梯度稀释反应。
(6)循环次数过多；增加模板量，将循环次数减少到30，缩短退火时间和延伸时间，或使用两个温度的PCR循环。
(7)退火温度过低。
(8)电泳系统有问题:
①缓冲液和电泳缓冲液在凝胶中的浓度差异过大；
②凝胶凝固不好；
③琼脂糖质量差。
(9)如果是PCR试剂盒，则有可能:
①试剂盒因运输和储存不当而失效；
②试剂盒本身存在引物选择、循环参数等质量问题。
(10)降解的旧模板膨胀也容易产生涂层。
4. 多条带出现在扩展产品中 （杂带）
(1)引物用量过大，引物特异性不高。引物的使用应改变或减少。
(2)循环次数过多。适当增加模板量，减少循环次数。
(3)酶消耗量高或酶质量差，应减少酶消耗量或更换另一来源的酶。
(4)退火温度低，退火和延伸时间长。退火温度应提高，变性和延伸时间应减少，两种温度的PCR也可扩展。梯度PCR反应优化退火温度，梯度设计为2度。
(5)样品处理不当。
（6）Mg2 由于Mg2的适当调整，浓度偏高 使用浓度。
(7)如果是PCR试剂盒，试剂盒本身的质量也可能有问题。
（8） 提前终止复制。经常使用非热启动聚合酶。冰上准备反应系统或使用热启动聚合酶。
（9） 反应缓冲液未完全融化或完全混合。确保反应缓冲液完全融化并完全混合。
（10） 引物特异性差。用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11） 引物过多。减少引物在反应系统中的用量。
（12） 模板太多了。质粒DNA的用量应该是<基因组DNA应为50ng<200ng。
（13） 外源DNA污染。确保操作清洁。
5.阴性对照出现条带
试剂、枪头、工作台污染。用新的试剂和枪头清洁工作台。
6.条带大小与理论不符
1) 污染。用新的试剂和枪头清洗工作台。
2) 使用错误的模板或引物。更换引物和模板。
3) 基因亚型。序列分析和BLAST研究研究研究基因。
