做Western Blot发光实验经常发生“淬灭”。一些朋友经常报告说，添加发光试剂后，你可以立即看到明显的亮光，但亮光很快就消失了。压片后，条带很弱，甚至什么都没有。造成这种情况的原因是什么？
为了解释这种情况的原因，我们必须首先了解ECL化学发光的原理。一般发光试剂包括鲁米诺和H2O2、发光增强剂和其他物质。发光试剂中的鲁米诺由HRP和HRP组成2O2发光增强剂加强了氧化和荧光。增强剂在HRP-鲁米诺-H2O2该系统的核心作用决定了ECL化学发光的发展。理想的发光增强剂是：1。发光灵敏度。目前，一般的发光增强剂可以将发光灵敏度提高1万倍至1万倍以上，并可以检测pmol甚至fmol级别的HRP。事实上，发光灵敏度不是问题。2.发光稳定性是目前研究的重点之一。发光不稳定的增强剂在某些情况下容易“淬灭”，即快速消耗发光试剂，几秒钟内发出强光，几秒钟内迅速消失，不易检测。3.底部或低背景是发展方向之一。由于化学发光反应对增加底部的因素非常敏感，为了获得准确可靠的结果，化学发光分析必须确保试剂的特异性，在没有人力资源或很少人力资源的情况下。
所以，Western Blot主要有两个原因：含HRP的抗体和发光试剂。由于某种发光试剂的长期应用，人们更加关注抗体，不知道发光试剂实际上会对实验结果产生重大影响。对于抗体，“淬灭”问题可以通过适当降低抗体浓度和快速操作来解决；对于发光试剂，可以选择稳定的发光试剂来解决“淬灭”问题。
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