细胞计数法 实验方法原理：细胞生长和分裂繁殖的体外培养能力可以用分裂指数来表示。它与生长曲线有关。例如，随着分裂指数的不断提高，细胞进入指数生长期。 分裂指数是指细胞群中分裂细胞的百分比，是测量细胞周期的重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验步骤： 一、消化细胞，将细胞悬液连接到含盖玻片的培养皿中。 二、CO2培养箱培养48小时，使细胞长在盖子上。 三、取出盖片，按以下顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：固定液固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→冲洗自来水。 四、盖片干燥后，反扣在载玻片上，镜检。 五、计算 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100% Brdu参与法 实验方法原理：细胞周期是指一代又一代细胞所经历的时间。从一个细胞分裂结束到下一个分裂结束。细胞周期反映了细胞增殖的速度。 缩时摄影可以用来测量单个细胞的周期，但不能代表细胞群的周期，所以其他方法主要用于测量群体周期。 BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后，可作为细胞DNA复制的原料。经过两个细胞周期后，细胞中两个单链都含有Brdu的DNA将占1/2，反映在染色体上，应表现为单体浅染。如果经历了三个周期，染色体中约有一半是两个单体，另一半是一深一浅。如果细胞只经历一个周期，两个单体都会深染。细胞周期的值可以通过计算分裂相中每个阶段的比例来计算。 一、试剂配制 当细胞生长到指数期时，将BRDU添加到培养液中，最终浓度为10 μg/ml。 秋水仙素加入3、44小时，使每毫升含有0.1 μg。 常规消化细胞48小时后到离心管，注意培养上清漂浮细胞也要收集到离心管中。 五、常规染色体制作。 6.将染色体玻片放在56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 离紫外灯管6的液体 紫外线辐射30分钟，cm处。 七、弃去2×用自来水冲洗SSC液。 八、Giemsa液染色10分钟，用自来水冲洗干燥。 九、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。 十、计算 细胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4)/100}(小时) 细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束到下一次分裂结束的活动过程，分为间期和分裂期两个阶段。 1.间期 间期分为三个阶段，即DNA合成前期(G1期)、后期(G2期)DNA合成期(S期)和DNA合成期。 （1）G1期 这一时期的长度因细胞而异。上次分裂完成后，体内大部分细胞分化并执行各自的功能。这个G1期的早期阶段特别叫G0期。在G1期的后期，细胞开始分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶。 （2）S期 S期是细胞周期的关键时刻。复制后DNA的含量增加了一倍，使体细胞成为四倍体，每个染色丝都变成了两个由丝点连接的染色丝。同时，还合成组蛋白，复制中心颗粒。S期通常需要几个小时。 （3）G2期 为分裂期做最后的准备。中心粒被复制，形成两个中心体，并合成RNA和微管蛋白。G2期相对恒定，需要1～1.5小时。 2.分裂期 细胞有丝分裂（mitosis）经前、中后、末期是一个由母细胞分裂成两个子细胞的连续变化过程。一般需要1～2小时。 （1）前期（prophase）染色质丝高度螺旋化，逐渐形成染色体（chromosome）。染色体短而粗，强碱性。两个中心体向相反的方向移动，在细胞中形成两极；然后以中心颗粒随体为起点合成微管，形成纺锤体。随着核仁与染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始分解成离散的囊泡状内质网。 （2）中期（metaphase）细胞变成球形，核仁和核被膜完全消失。染色体均移动到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着在每个染色体的着丝点上。共有46个染色体，其中44个是常染色体，2个是性染色体。男性染色体组型为46，XY，女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状，均由两个染色单体通过狭窄的着丝点连接而成。 （3）后期（anaphase）由于纺锤体微管的活动和纵向裂纹，每个染色体的两个染色单体分开，向相反的方向移动，靠近各自的中心体，染色单体分为两组。同时，细胞波拉长，由于赤道细胞膜下环绕微丝束的活动，细胞变窄，呈哑铃形。 （4）末期（telophase）染色单体逐渐解螺旋，染色质丝和核仁再次出现；内质网囊泡组合 为核被膜；组胞赤道部缩窄加深，最终完全分裂为两倍体子细胞。 根据细胞在体内分裂能力可分为三类： ①增殖细胞群，例如，造血干细胞、表皮和胃肠粘膜上皮的干细胞。这些细胞始终保持活跃的分裂能力，并连续进入细胞循环。 ②细胞群不再增殖，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们失去了分裂能力，也被称为终末细胞（end cell）。 ③细胞群暂时不增殖，例如，肝细胞、肾小管上皮细胞和甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，具有特定功能的细胞通常处于G0期，因此也被称为G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞再次进入细胞周期。例如，在肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。 流式细胞仪 实验方法原理：流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下，细胞排列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过逐一检测流动液体中排列的细胞，得到细胞的光散射和荧光指标，分析其体积、内部结构DNA、RNA、物理化学特征，如蛋白质、抗原等。 细胞中的DNA含量随细胞周期的进程而周期性变化。例如，G0/G1期的DNA含量为2C，G2期的DNA含量为4C。通过流式细胞仪测量细胞中DNA的相对含量，可以分析细胞周期各时相的百分比。 实验步骤： 1、取对数生长期细胞，倒入培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，8000 rpm，离心15 去上清的min。 二、PBS洗2次，加0.5 MLPBS吹均匀，一定要吹散。 三、用5 ML注射器吸起细胞，用力打入5 mL 密封膜密封在70%(预冷)乙醇中。4℃固定过夜(可长至2周)。 四、800 rpm 15 Min收集固定细胞，PBS洗两次。 五、用0.4 MLPBS重悬细胞，转移到Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)。 六、加RNase-A约3 μL的最终浓度约为50μg/mL ，37℃水浴消化30 min； 七、加PI约50 μL最终浓度约为65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 八、用300目尼龙网过滤(孔径40~50微米)，上机检测。 九、样品分析、测定、打印。 常见问题 1.Q：胃粘膜组织的DNA含量和双体检查需要几周的时间才能进行流细胞检查。如何保存胃组织？低温保存还是乙醇固定？还是固定后低温保存？ A：以乳腺细胞DNA含量测定为例。取得组织后，先将其处理成单细胞悬液，然后加入70%的冰乙醇固定。确保冰乙醇的最终浓度为50%。这样，固定的细胞悬液至少可以保存12小时，最多可以保存一个月，然后在计算机检测前添加PI综合染料。它保存了近三周，结果还可以。变异系数为5%. 2.PI分析细胞周期和凋亡率 Q：(1)RNAS酶用什么制备？PBS配吗？ A：用PBS准备RNasea没有问题，但要注意沸水浴去除DNase的活性。 Q：(2)RNAS酶可以一起检测细胞周期和凋亡率吗？ A：细胞周期和凋亡率同时用流式细胞仪测定。 Q：（3）Triton－x－100是固定剂，用了700。％冷乙醇(是4℃吗？)，不需要Triton吗？－x－100固定了？ A：Triton X-100起透化作用，不是固定剂，可以用75％乙醇固定在-20度。 Q：(4)应该设置哪些内部参考标准(5)％鸡红细胞)？ A：比较必须是必要的，这是根据自己的需要设置的。 3.Q：RNA酶在流体检测细胞周期中所需的温度？ A：事实上，有些人对RNA酶在凋亡检测和制样过程中使用的必要性有不同的看法。这种观点的人认为RNA酶在环境中无处不在。常规制样过程中接触的试剂和环境中的RNA酶足以降解样品中的RNA。因此，为了简单地进行实验操作，有些人不添加RNA酶或使用PI染液作为您参考的方法。但经典的方法是“先加RNA酶37度孵化30min，再加PIN 4度孵育30min”。由于低温会削弱分子运动，增强荧光染料组合的稳定性，减少可能的荧光损失，因此在染色过程中使用4度。 4.Q：肿瘤细胞测量周期。70％乙醇是否必须与PBS和乙醇相匹配，水分细胞会破裂，PBS和乙醇会出现絮状物？75％用瓶装75酒精固定乙醇％乙醇可行吗？ A：首先用冷PBS悬浮细胞，约1-2ml，充分悬浮，使细胞完全分散成单细胞。然后慢慢加入无水乙醇，最终浓度为70-75%。不直接加入75%乙醇的原因是直接加入乙醇会导致细胞团聚，很难重新悬浮成单细胞。乙醇固定后无细胞沉淀。 5.Q：流式分析细胞周期收集了106个方形细胞，但乙醇固定后，细胞也看到细胞沉淀，但PBS洗涤两次后，基本上没有细胞沉淀，机器发现没有细胞。这是怎么回事？如何解决这个问题？ A：在洗细胞的过程中很可能会丢失，解决方案是： (1)尽量使用尖底离心管和水平离心机 (2)离心后尽量用吸管吸上清，不要倾倒；吸上清水膜最好留1mm左右，不要吸完。 (3)离心的速度或时间可以稍微增加一点 (4)每次加抗体时，吸头最好不要接触液体表面；混合时最好不要用吸头吹，以免吸头挂壁带走部分细胞。
