目的基因不能直接集成到大多数真核细胞中。常用的方法是将目的基因包装成病毒来感染细胞，以满足实验的需要。病毒有很多种，包括慢性病毒和腺病毒。前面的文章特别介绍了慢性病毒和腺病毒的原理，可以搜索关键词查看。今天主要介绍病毒感染细胞的实验过程。
1.构建目的基因到载体
- 构建手段
克隆方案一般是根据原始质粒信息确定的，有以下两种方法。
1)如果原始质粒与载体有匹配的酶切位点，则用相应的内切酶切割相应的片段，回收并连接到载体、酶切割和测序识别
2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带特殊接头的引物进行PCR扩展，获得目的片段，用相应的内切酶切割相应的片段，回收并连接到穿梭载体、酶切割和测序识别
- 质粒载体
1）概念
可独立复制的环状DNA双链结构，包括真核生物细胞器（主要是线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子
2）特征
抗生素抗性基因通常存在于质粒上，如四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因。有些质粒被称为附加体(episome)，这种质粒可以整合成真菌染色体，也可以从整合位置切割成游离染色体的DNA分子。质粒可以在宿主细胞内外复制。通过一些特性，人们可以在质粒中构建一些目的DNA片段，通过将其转化为大肠杆菌，通过选择培养基进行筛选，不断复制，从而获得目的产物。
2、大肠杆菌中质粒DNA的转化
连接目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了扩大目的基因在大肠杆菌中，然后提取质粒。以下是质粒DNA在大肠杆菌中转化的三个步骤。
- 制备大肠杆菌感觉态细胞
1)从大肠杆菌平板上挑选一个单菌落在3mlLB培养基试管中，37℃振荡培养过夜。
2)将0.4ml菌液转移到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h
3)菌液转移到50ml离心管中，10min放置在冰上
4℃离心10min(4000r/)min）
5)倒出培养液，将管口倒置，使培养液流尽
6)用冰浴0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
7.4℃离心10min(4000r/)min）
8)倒出上清液，用冰浴0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞(放在冰上)
9)分装细胞，200ul一份，4℃保存
- 质粒DNA的转化
1)取200ul新鲜感觉细胞，加入质粒DNA2ul混合，冰浴30min
2)将离心管放在42℃保温90s
3)冰浴2min
4)每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h(150r/min）
5)在选择性培养基上涂抹适当体积(100ul)的复苏细胞，正置30min
6)倒置平盘37℃，12~16h，菌落出现
- 颗粒提取步骤
1)在LB培养基中取1~4ml培养过夜菌液，12000转离心1min，弃清
2)加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液)混合物，漩涡剧烈振荡，直至菌体完全再次悬浮，室温静置1-2min。
3)加入250ul溶液Ⅱ(细胞裂解液)，轻轻反复搅拌5-6次。室温放置1-2min，使菌体完全分解，直至形成清晰的裂解溶液。
4)加入350ul溶液Ⅲ(中和液)，立即轻轻反复颠倒5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
5)12000室温离心10min，收集上清。
6)将上部放置在DNA纯化柱中，静置1-2min。
7)12000转离心1min，弃滤液。
8)添加500ul溶液PB(洗涤液)12000转离心1min，弃滤液的目的是洗脱硅胶膜上吸附的蛋白质、盐等杂质，获得优质颗粒DNA。
9)加入500ul溶液W(去盐液)，12000转离心1min，弃滤液，重复一次。
10)12000转离心3min，彻底去除净化柱中残留的液体。
11)将DNA纯化柱放置在新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent(无菌双蒸水，PH为8.0-8.5)，室温放置2min。
12)12000转离心1min，此时管底为高纯度质粒DNA，质粒保存在-20℃。
颗粒提取步骤：吸收液体培养基于1.5ml离心管中1.2万转离心1min，弃上清，吸收培养基重复离心弃上清离心，留少量菌液作为菌种保存，可直接放置在-20℃-250ulbufffferS1悬浮细菌，悬浮均匀-250ulbuffffferS2上下翻转4-6次，使菌体裂解-加350ulbufferS3温和上下翻转12000离心10min-取上清液转移到专用制备管(2ml)12000转离心1min，弃滤液-加500ulbufferW112000转离心1min，弃滤液-加500ulbuffferW21200转离心1min，重复-将制备管放回2ml离心管12000转离心1min-将制备管放入新的1.5ml离心管中，加入60~80uleluent或离子水，室温1min1200转离心1min-移除制备管，将有质粒的离心管放入4℃或-20℃。
