细胞周期与细胞凋亡分析

     CCAA试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是基于PI 染色(Propidium staining)分析细胞周期和细胞凋亡的试剂盒。 以engreenCCAA试剂盒为例，说明检测方法。

1.收集和调整细胞浓度1×106/ml，后续操作采用1ml单细胞悬液。
1)壁细胞:小心吸收细胞培养液，用胰酶消化细胞，制备单细胞悬浮液。离心1000克3-5分钟，沉淀细胞。加入约1ml预冷PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸收和清除，可残留约50分钟μl左右的PBS，以避免吸收细胞。轻轻弹击离心管底，适当分散细胞，避免细胞形成。
2)悬浮细胞:1000g离心3-5分钟，沉淀细胞。添加约100克 ml预冷PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心清除，可残留约50个μl左右的PBS，以避免吸收细胞。轻轻弹击离心管底，适当分散细胞，避免细胞形成。
3)组织细胞:用剪刀将组织块切成尽可能小的小块后，用0.25%胰酶消化0.5-1小时，用200-400目筛过滤得到单细胞悬液。离心1000克3-5分钟，沉淀细胞。添加约1 ML预冷PBS，重悬细胞，再离心沉淀细胞。如果组织难以消化，可以添加适量的胶原酶。
2.细胞固定:用预冷75%乙醇4℃固定1 小时到晚上。固定时，在振荡器上轻轻振荡细胞，慢慢滴75%乙醇。直接添加会导致细胞团聚，难以重新悬浮成单细胞。或者先用冷PBS充分悬浮细胞，然后慢慢添加无水乙醇，使最终浓度达到70-75%。
3.去除固定液：离心沉淀细胞，小心去除上清，用冷PBS 洗涤细胞，然后离心。重复几次以去除固定液。PBS可以残留约50微升，以避免吸收细胞。轻轻弹击离心管底部，以适当分散细胞，避免细胞形成。
4.加入500ulCCAA溶液(PI染液)（engreen），4℃避光孵化30分钟后轻轻混合。
5.上机检测，记录488nm处激发波长的红色荧光进行分析。