第一，DNA聚合酶
DNA聚合酶催化下的DNA体外合成反应涉及分子克隆的许多步骤。大多数酶在作用时需要模板，而合成产品的序列则与模板相辅相成。虽然此时效率较低，但大多数聚合酶优先考虑DNA模板，但也可以复制RNA。DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)中最常用的DNA聚合酶。DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4和T7噬菌体编码的DNA聚合酶，修饰后的T7噬菌体DNA聚合酶(测序酶和测序酶2.0版)，以及耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶和Amp1iTaqTM)。有一种聚合酶，即反转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)可以优先复制RNA，但也可以接受DNA模板，因此可以以RNA为模板催化合成双链DNA。最终还有一种DNA聚合酶，它根本不复制模板，而只是将核苷酸添加到现有DNA分子的末端，这种DNA聚合酶被称为末端转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶)。
第二、RNA聚合酶依赖于DNA
SP6噬菌体可以合成依赖DNA的RNA聚合酶，该酶可以识别双链DNA模板上相应噬菌体的特异性启动子，井可以沿着这个双链DNA模板开始合成RNA。这种酶可以在体外合成大量与外源DNA链相辅相成的RNA。这种外源DNA克隆在专门设计的载体中，位于启动子的下游。RNA(Butler和模板任何链条相辅相成的RNA，可以通过改变外源基因上游的启动子方向来合成。Chamberlin,1982;1984年，Melton等。T7和T3噬菌休也可以合成依赖DNA的RNA聚合酶，这种酶可以识别双链DNA模板上适当的噬菌体特异性启动子，井沿着这种双链DNA模板开始合成RNA。
与SP6噬菌体RNA聚合酶相同，T7和T3噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶在体外的应用。在大肠杆菌中，T7和T3噬菌体RNA聚合酶已表达为1984;Tabor和Richardson,1985;1986年，Morris等。此外，T7噬菌体RNA聚合酶也在酵母中被克隆和表达(Chen等，1987)。通过这种方式，带有T7噬菌体启动干燥的载体可以用来表达体内的克隆基因。
三、连接酶、激酶和磷酸酶
用来拼接两个DNA的酶叫做连接酶。T4噬菌体编码是分子克隆中最常用的连接酶。还有一种用途狭窄的连接酶，用于未感染的大肠杆菌。这两种酶主要用于5'端带磷酸基团的DNA基物。
RNA连接酶也是T4噬菌体代码的一种酶。这种酶可以使其含有5个酶。′单链RNA(或DNA)在磷酸末端和3'羟基端共价连接，但这种酶的主要用途是标记RNA的3'末端，即标记3',5'-二磷酸单核苷。(pNp)加入3'羟基端的RNA。
在连接之前，如果DNA缺乏所需的磷酸基团，可以通过T4噬菌体多核苷酸激酶进行处理，使DNA磷酸化。取而代之的是，用酶去除5'磷酸基团后，DNA就不能再连接了。
四、核酸酶
磷酸二酯键能切断聚核苷酸链的酶，称为核酸酶。在磷酸二酯键的P-O位置，核酸酶属于水解酶。
核酸酶是一种作用于水解核苷酸之间磷酸二酯键的核酸，在核酸分解的第一步。它作用于高等动植物中的磷酸二酯键。
不同来源的核酸酶具有不同的特性和作用。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶。（RNase），一些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase），有的核酸酶专一性低，既可作用于RNA又可作用于DNA，所以统称为核酸酶。（nuclease）。核酸酶可以分为核酸外切酶，根据核酸酶作用的位置不同，（exonuclease）还有核酸内切酶（endonuclease）。
