Western，又称Westernblolllolllo、Westernblotting、Western印记是用抗体检测蛋白质的重要方法之一。可按以下步骤操作。
1.收集蛋白质样品(Proteinsamplepreparation)
用细胞裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。然后确定每个蛋白质样品的蛋白质浓度。
2.电泳(Electrophoresis)
1）SDS-配制PAGE凝胶
SDS-PAGE凝胶(分离胶和浓缩胶)可以参考一些文献资料进行配制
2）样品处理
在收集的蛋白质样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白质样品缓冲液。例如，2X或5XSDS-PAGE蛋白质样品缓冲液。使用5XSDS-PAGE蛋白质样品缓冲液可以减少样品体积，在相同体积的样品孔中可以提供更多的蛋白质样品。5XSDS-PAGE蛋白质样品缓冲液可参考相关文献，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白质。
3）样品和电泳
* 冷却到室温后，将蛋白质样品直接取样到SDS-PAGE胶加样孔。为了便于观察电泳效果和转膜效果，判断蛋白质分子量，最好使用预染蛋白质分子量标准。
* 电泳时，通常建议在上胶时使用低压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下胶时使用高压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低压可设置在80-100V，高压可设置在120V左右。
* 为了方便电泳，整个SDS-PAGE过程也可以采用恒压的方式，通常将电压设置在100V，然后设定时间为90V－120分钟。定期设置可以避免过度电泳。通常，当溴酚蓝到达胶水底部附近时，可以停止电泳，或者根据预染蛋白分子量标准停止电泳。预计目的蛋白可以在适当分离后停止电泳。
3.转膜(Transfer)
1）我们建议在Western实验中选择PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但是硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中容易开裂，尤其是用镊子夹取的时候。请参考厂家推荐的使用步骤。通常，如果使用Bio-Rad标准湿式转膜装置，可以将转膜电流设置为300-400ma，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20ma转膜过夜。具体的转膜时间取决于目的蛋白的大小。目的蛋白的分子量越大，转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，转膜时间越短。
2）在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会出现非常严重的发热现象。最好把转膜槽放在冰浴里转膜。转膜的效果可以观察预染蛋白质的分子量标准。通常，分子量最大的1-2条带很难转移到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液染色，观察转膜的实际效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液染色完成转膜的SDS-PAGE胶，观察蛋白质残留情况。
4.封闭(Blocking)
1）转膜完成后，立即将蛋白膜放入预先准备好的洗涤液中，冲洗1-2分钟，冲洗膜上的转膜液。从转膜完成后的所有步骤开始，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则很容易产生更高的背景。
2）用微型台式真空泵吸收所有洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上慢慢摇动，室温关闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，它们可以在4℃下过夜。
5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)
1）参照一抗说明书，按适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。
2）用微型台式真空泵吸收所有封闭液，立即加入稀释的抗性。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵化一小时。如果抗孵化一小时效果不好，可以在4℃下缓慢摇动孵化一夜。
3）回收一抗。加入western洗涤液，在侧摆摇床上慢慢摇动洗涤5-10分钟。吸收所有洗涤液后，加入洗涤液，洗涤5-10分钟。一共洗三次。如果结果背景高，可以适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。
6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)
1）参照二抗说明书，用Western二抗稀释液按适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。
2）用微型台式真空泵吸收洗涤液，立即加入稀释的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇晃孵化一小时。
3）回收二抗。加入western洗涤液，在侧摆摇床上慢慢摇动洗涤5-10分钟。吸收洗涤液后，加入洗涤液，洗涤5-10分钟。一共洗三次。如果结果背景高，可以适当延长洗涤时间，增加洗涤次数。
7.蛋白检测(Detectionofproteins)
1）参考相关说明书，可使用超敏ECL发光液检测蛋白质。
2）洗片时可使用x光自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒配制显影液和定影液进行手动洗片。
8.膜的重复使用(Membranerecovery)
如果蛋白质样品非常珍贵，可以用Western一抗二抗去除液对蛋白质膜进行处理，以重复使用蛋白质膜。
