1. 如何有效设计引物？
(1)保守区采用Oligo或Primer设计引物，长度一般为18-27bp，上下游引物TM值为60-75℃，GC含量=40%-60%。引物本身和引物之间不应有互补序列，以避免发夹结构。
2. PCR电泳没有扩展条带
(1)酶失活或在反应系统中未添加酶。TaqdNA聚合酶因保存或运输不当而失活，通常通过更换新酶或使用另一种来源的酶来获得令人满意的结果。
(2)模板中含有杂质。特别是甲醛固定和石蜡包埋的组织通常含有甲酸，导致DNA脱嘌呤，影响PCR。
(3)变性温度是否准确:PCR仪表示温度是否与实际温度一致，过高酶在前几个循环中迅速失活；如果过低，模板变性不彻底。
(4)蛋白酶和核酸酶被污染在反应系统中，反应系统应在95℃加热5-10分钟，才能添加Taq酶。
(5)引物变质失效。合成引物是否正确。由于储存条件不当，是否纯化或失活。
(6)引物错误。用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(7)DNA凝胶电泳时加阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。
3. PCR产物量过少
(1)退火温度不合适。梯度PCR反应优化退火温度设计为2度。
(2)DNA模板太少。增加DNA模板的数量。
(3)PCR循环不足。增加反应循环。
(4)引物量不足。增加系统中引物的含量。
(5)延伸时间过短。延伸时间设置为1kb/分钟。
(6)变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。
(7)DNA模板中有抑制剂。确保DNA模板清洁
4. 扩展产品在凝胶中涂布或片状条带扩散
(1)酶量过高。减少酶量；酶质量差，替代另一个来源的酶。
(2)DNTP浓度过高。降低DNTP浓度。
(3)Mgcl2浓度过高。可适当减少其用量。
(4)模板量过大。质粒DNA的用量应该是<基因组DNA应为50ng<200ng。
(5)引物浓度不够优化。重复PCR对引物进行梯度稀释反应。
(6)循环次数过多；增加模板量，将循环次数减少到30，缩短退火时间和延伸时间，或使用两个温度的PCR循环。
(7)退火温度过低。
(8)电泳系统有问题:
①缓冲液和电泳缓冲液在凝胶中的浓度差异过大；
②凝胶凝固不好；
③琼脂糖质量差。
(9)如果是PCR试剂盒，则有可能:
①试剂盒因运输和储存不当而失效；
②试剂盒本身存在引物选择、循环参数等质量问题。
(10)降解的旧模板膨胀也容易产生涂层。
5. 多条带(杂带)出现扩增产品
(1)引物用量过大，引物特异性不高。引物的使用应改变或减少。
(2)循环次数过多。适当增加模板量，减少循环次数。
(3)酶消耗量高或酶质量差，应减少酶消耗量或更换另一来源的酶。
(4)退火温度低，退火和延伸时间长。退火温度应提高，变性和延伸时间应减少，两种温度的PCR也可扩展。梯度PCR反应优化退火温度，梯度设计为2度。
(5)样品处理不当。
（6）Mg2 由于Mg2的适当调整，浓度偏高 使用浓度。
(7)如果是PCR试剂盒，试剂盒本身的质量也可能有问题。
(8)提前终止复制。非热启动聚合酶经常发生。冰上准备反应系统或使用热启动聚合酶。
(9)反应缓冲液未完全融化或完全混合。确保反应缓冲液完全融化并完全混合。
(10)引物特异性差。用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
(11)引物过多。减少引物在反应系统中的用量。
(12)模板量过大。质粒DNA的用量应该是<基因组DNA应为50ng<200ng。
(13)外源DNA污染。确保操作清洁。
6. 条带出现阴性对照
(1)试剂、枪头、工作台污染。用新的试剂和枪头清洁工作台。
7. 条带的大小与理论不符
(1)污染。用新的试剂和枪头清洁工作台。
(2)模板或引物使用错误。检查引物是否会扩展部分条带和模板是否正确。
3)基因亚型。对研究基因进行序列分析和BLAST研究。
8. 假性条带继续出现
（1）起始退火温度过低，或目的扩展产品与非目的产品的T值相差不大。尝试适当提高PCR温度或设置降落PCR以减少循环数量。
9. 菌落PCR检测有条带，接种大摇后无条带
（1）由于菌落PCR的假阳性概率仍然相对较高，因此PCR可以重新以菌落和菌液为模板进行比较检测。如果上述结果仍然出现，推测可能是平板上连接液中未连接载体扩展引起的目的带。进一步的质粒PCR检测可以证明目的片段是否真正连接成功。
