降落PCR实验原理及步骤

降落PCR（touchdown PCR），PCR技术主要用于优化PCR条件。在许多情况下，引物的设计使PCR难以进行，如特异性不够容易错配。过高的退火温度会使PCR效率过低，但过低的退火温度会使非特异性扩展过多。

实验材料:

基因样品

仪器、耗材：

PCR仪

实验步骤：

1、反应体积为50 μl。

2、人类CD137胞膜外基因的PCR扩展系统：CD137-PCDNA3质粒4 μl，P1，P2各0.5 μmol/L，MgCl₂ 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

3、HIgG1Fc片段PCR扩展系统：PGEM-T质粒4，包含HIgG1Fc μl，P3、P4各0.4 μmol/L，MgCl₂2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

4、PCR扩展系统，HBVDNA多聚酶基因：

(1)第一轮:HBVDNA模板4 μl，P5、P6各0.25 μmol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.

(2)第二轮:第一轮PCR产品4，稀释5倍μl为模板，P7、P8各0.25 μmol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。

5、上述反应成分分分别添加到每个灭菌PCR管中，100℃煮5 min，立即冰浴5 min，PCR程序如下:添加TaqDNA聚合酶，混合均匀，离心

6、取 10 μl PCR 膨胀产品，在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外线下观察膨胀产品。

注意事项：

由于目标是在早期循环中避免低TM值匹配，热启动技术应用于TD-PCR。在设计过程中，退火温度的范围应超过15℃左右，从高于估计TM值至少几度到低于10℃

分析实验结果

1、若无条带：

(1)反应系统错误。重新配置反应系统，确保添加各种试剂的量没有问题。

(2)PCR程序错误。检测PCR仪程序是否正确。

(3)DNA胶问题。DNA凝胶电泳时添加阳性对照。

(4)退火温度不合适。梯度PCR反应优化以2度为梯度的退火温度。

(5)DNA模板太少。增加DNA模板的数量。

(6)引物错误。用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(7)DNA模板中有抑制剂。确保DNA模板清洁

(8)模板结构复杂。添加DMSO、BSA或甜菜碱。试着减少PCR。

2、PCR产品量过少：

(1)延伸时间过短。延伸时间设置为1kb/分钟。

(2)变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。