实验室小白遇到了引物设计，一片迷茫，不知所措。
师姐：现在常用的引物设计软件有Oligo、PrimerPremier、DNA man等，以及在线引物设计软件。我们实验室的软件会给你带来。
(师姐比师兄靠谱，真的是手把手教的，边操作边讲解。)
1. 在NCBI上搜索基因，找到基因的MRNA，在CDS选项中找到编码区的位置，在下面的origin中，Copy编码序列作为软件查询序列的候选人。
2. PrimerPremier5.0安装上。
3. 打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 输入序列窗口出现，Copy目的序列在输入框中(选择As)，序列也可以直接翻译成蛋白质。点击Primer进入引物窗口。
4. 该窗口可以链接到“引物搜索”、点击Search按钮进入引物搜索框，选择“引物编辑”和“搜索结果”选项PCR primers”，“Pairs设置搜索区域、引物长度和产品长度。Search 相应的参数可以设置在Parameters中。一般来说，如果没有特殊需要，可以默认选择参数，但由于100，产品长度可以适当变化～200bp产品电泳跑散，可以选择300～500bp。
5. 点击OK，软件开始自动搜索引物。搜索完成后，结果窗口将自动跳出。默认情况下，搜索结果将根据评分进行（Rating）排序，点击任何搜索结果，在“引物窗口”中显示引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，以及引物的各种信息。
6. 对于引物序列，可以简单查看，避免以下情况:3‘端不要以A结束，最好是G或C、T；3’不要连续连接三个碱基，比如GGG或者CCC，否则容易造成错配。
这个窗口需要重点检查:TM应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％上游引物和下游引物的TM值最好不要相差太大，最好在2度以下。
窗口底部列出了两个引体的二级结构信息，包括发夹、二聚体、引体之间的交叉二聚体和错误的引发位置。如果按钮显示为红色，则表示有二级结构，请单击红色按钮查看相应的二级结构位置图。
这些二级结构不应该存在于最理想的引物中，即这些按钮都显示为“None“好吧。但有时很难找到满足所有条件的引物，因此可以适当放宽要求。例如，如果引物不匹配，您可以调查错误匹配的效率，以及它是否会显著影响产品。
7. 在Primer5窗口中，如果您认为某对引物合适，可以单击搜索结果窗口中的引物，然后在菜单栏中选择File-Print-Current pair，PDF虚拟打印机可转换为PDF文档，其中包含引物的详细信息。
8. 当然，引物确定后，对上下游引物进行Blast分析。一般来说，会发现其他一些基因的同源序列。此时，只要没有交叉的其他基因的同源序列，就可以对上下游引物的Blast结果进行比较分析。
(1)在blast中选择nucleotidede blast
(2)chose search 在set中，database根据操作基因的种属选择human、mouse或others。在program somewhatt在selection中选择 similar sequences 点击blast按钮。
(3)等待几秒钟后，出现显示blast结果的网页。线段的颜色和上面的分数越高，特异性越好。(这些序列与上游引物相匹配，并与下游引物相互补充，理论上可以扩展基因片段。没有连接意味着单个引物与基因一致。)
(4)点击线段跳转到基因的结果信息总结:
（Accession：点击后，数据库系列的身份证可以获得序列的信息
Dessecription：简单描述系列。
Total score：高的是两线段之间有连线。
E value：被比较的两个序列不相关的可能性。E值越低越有意义。)
(5)在结果中找到目的基因引物的正确性通常没有问题。
(如果找到大量同一物种的不同基因，分数也很高，说明引物设计的特异性不高，容易出现非特异性扩展。)
