以下程序描述了使用同步DNA的修饰染料核苷酸 荧光DNA是通过缺口翻译切割制备的，缺口翻译是通过探索来修改DUTP 和dTP 完成荧光素或花青的最佳条件(Keller 1993; Yu et al. 1994; Zhu et al. 1994) 。该方法用于四甲基罗丹明、德克萨斯红、香豆素和bodipy 修饰核苷酸也可能适用，但染料类型、接头、核苷酸和聚合酶类型对标记物的掺入效率和DNA标记 产量有一定的影响(Yu et al. 1994; Zhu et al. 1994) 。以下是Biological Detection Systems开发的方法。
1) 准备以下材料
- 250μl 去离子H20 (DI-H20)
- 25μl 10x 缺口翻译缓冲液(NTB) 含有0. 5mol/L Tris-HCl (pH7. 2)
- 0.1 mol/L MgSO4，1mol/L DTT
- 25μl 200mol/L dNTP 标记混合物含有200种μmol/L 各种未标记的DATP 、dGTP 将DTTP调到pH7.00
- 5μl 1 mol/L 荧光素－dCTP
- l0μg DNA 模板，如完整质粒、纯化片段或PCR 扩增产物
- 25μl DNase I, 在1x NTB 3.33mu/ml
- 100 单位大肠杆菌DNA 聚合酶I
- 42μl 10 mol/L NH4OAc
- 333μl 100％乙醇(4℃)
- 1μl 70% 乙醇(4℃)
- 25μl (pH8)TE缓冲液.0)
- 常规琼脂糖1% x TBE 凝胶鉴定标记产品
2) 将配备去离子水(最终体积250μl) 的0.5ml 小管冰浴，加人25μl 的10 x TVTB，25μl 200 mmol/L dNTP 标记混合物， 5μl 1mol/L 荧光DCTP， 10μg DNA 模板， 25μDNase稀释 I，和100 单位E. coli DNA聚合酶，用加样器上下轻轻混合几次
3）16℃温浴1小时
4) 样品分为两份(每份125份)μl) 于1.5ml 小管中，加42 μl 10 mol/L NH4OAc并加333μl 乙醇(4℃)100% ，混合，冰浴至少2小时， 样品4℃过夜
5) 16000g 4℃ 离心30min， 弃上清，用1毫升 冰冷(4℃) 70% 乙醇洗涤沉淀
6) 真空干燥，直到所有液体(约5min)被去除
注：不要干透
7) 加25μl TE (pH8.0) 在每根管道中，37℃ 温浴20min 至3 小时振荡并用加样器吹打颗粒溶解
8) 16000g 离心5min， 上清移至新管
9) 取10μl 鉴定，其余储存在 -20℃
10) 产物鉴定。
目的是测量DNA 携带荧光物的百分比 (L%) 并按照程序生成标记DNA的产量
