PCR 在模板中，通过热稳定酶，dNTPs 和一组和片段3′ 在序列互补引物的存在下，插入物的顺序扩展(Saiki et al. 1988) 。PCR 该技术提供的另一个优点是将校正后的核苷酸混合到插入片段的扩展中，因此可以生产没有载体标记的探针，这排除了由于缺口翻译等其他方法引起的载体序列的非特异性标记。
目前，有一种方法可以掺入生物素化核苷酸(Lo et al. 1988) 。DCTPP在扩展中与人混在一起 该程序采用BDS 使用知Ampli的方法 Taq DNA 根据描述的程序，用dutp染料直接标记聚合酶(Yu et al. 1994; Zhu et al. I 988) 。 以下例子针对Cy3 – dCTP 典型标记物产量每反应1 ~ 2μg。对于鉴定和试验，可以建立足够的反应数
1)准备以下材料
| 100μg | 无离子H20 |
| 10μl 10x | Ampli Taq缓冲液 |
| 4μl 25 mmol/L | MgCl2 |
| 2μl 10mmol/L | dATP |
| 2μl 10mmol/L | dGTP |
| 2μl 10mmol/L | dTTP |
| 5μl 1mmol/L | dCTP |
| 15μl 1mmol/L | Cy3TM– dCTP |
| 1μl 100mmol/L | 正向引物 |
| 1μl 100mmol/L | 反向引物 |
| 1- 10ng | DNA线性化质粒模板 |
| 1μl | Ampli Tag DNA 聚合酶(5 单位／μl) （ Perkin-Elmer) |
2) 在冰浴0.5ml 在灭菌管中加入以下物质，加水至1000μl
| 10μI | Ampli Taq DNA 聚合酶缓冲液 |
| 4μl 25mmol/L | MgCl2 |
| 2μl 各种10 mmol／L | dATP 、dGTP 和dTTP |
| 5μl 1mmol/L | dCTP |
| 15μl | Cy3TM– dCTP |
| lμl | 各种寡核苷酸引物 |
| 1 – 10ng | 模板DNA |
| lμl | Ampli Taq DNA 聚合酶 |
轻轻混合，快速离心到管底。
使用无油管或覆盖矿物油
3) 完成PCR循环仪，参数如下：
| 第一循环 | (插入片段1kb) |
| 95℃ 4min | （预变性） |
| 35℃ | 循环 |
| 95°C 1min | （变性） |
| 60℃ 1min | （退火） |
| 72℃ 3min | （延伸） |
最后一个循环完成后，扩大72℃ 延伸5min
4) 加人33μl 10mmol/L NH4OAc，2倍体积100％乙醇沉淀样品，然后过滤，如果样品沉淀， 4℃至少需2 小时。16000g 离心30分钟，然后用 1ml 70％清洗乙醇，干燥5 分钟
5) 在25μl 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 1 mmol/L EDTA (TE8.0) 悬浮沉淀， 37℃ 温浴20分钟-3 小时。轻混样品， 16000g 离心5 几分钟后，上清转移到新管进行鉴定。合井前各管道。
6) 产物鉴定
注意事项
- DNAA活性染料和DNA标记 避光保存，但不需要在黑暗中操作。样品不应长时间（数小时）放置在阳光下，特别是在强光房间。用锡箔包裹，荧光标记的样品特别敏感。
- 在1 ％标记探针在琼脂糖凝胶中可见，荧光素、德克萨斯红和Cy3 肉眼容易观察标记探针，但Cy5 荧光处于人视网膜敏感性的边缘，与标准物多聚核酸梯度(1kb) 将探针与迁移进行比较，用0.5mg/ml溴化乙锭染色观察
- PCR不同模板 Mgclll的扩展和标记需要调整2 浓度、模板含量、循环次数
