本方案介绍了如何合成SiRNA
双链siRNA形成了有义链和反义链的复性， 使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链SiRNA 进行分析。
试剂
丙烯酰胺： 双丙烯酰胺(19) : 1, 40%, m/V)
过硫酸铵( 10%, m/V)
复性缓冲液(10 X )
2‘ 脱保护缓冲液[1000 mmol/L 乙酸，四甲基乙二胺，四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH 至3.8]
DNA 分子质量标准
非变性凝胶上样缓冲液(10X)
无核酸酶水
siRNA
10mg/mL 溴化乙锭
TBE 缓冲液( 5X, 0.5 X)
设备
离心机
加热模块(37 °C, 60 °C, 95°C)
微量离心管(1.5)mL)
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪
分光光度计
真空离心蒸发浓缩器或替代品
紫外灯
涡旋振荡仪
方法
1.将siRNA 溶解在无核酸酶水中。用分光光度计测量SiRNA 的浓度 。将
RNA 将溶液放在冰上，防止RNA 降解。
2.生成以下复性步骤20μmol/L 双链sirna 溶液。
| SiRNA有义链 | 2nmol |
| SiRNA反义链 | 2nmol |
| 复性缓冲液(10X) | 10μL |
| 无核酸酶水 | 补足至100μL |
3. 95 °C 孵育5mm, 37 °C 孵育2h 。SiRNA 溶液保存于－20°C 或者－ 80 °C 。
4. 使用以下试剂制备12个浓度％非变性聚丙烯酰胺凝胶(如Bio-Rad MiniPROTEAN，8cmX 7.3cmX 0.75mm)
| TBE 缓冲液( 5 X ） 丙烯酰胺： 双丙烯酰胺( 19: 1， 40%, m/V) 去离子水 |
1mL 1.5mL 补足至5mL |
| 在室温下混合均匀，然后加入 | |
| 过硫酸铁(10%， m/V) TEMED |
50μL 5μL |
5. 快速混合上述溶液， 然后倒入制胶仪中聚合。
6. 双链sirna 溶解于2μmol/L 的1X 上样缓冲液中的非变性胶。
7. 正义和反义SiRNA 分别溶解千4μmol/L 的l X 上样缓冲液中的非变性胶。
8. 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 电泳在缓冲液中进行，电压为5V 。电泳需要低电
在压力条件下进行，以避免样品的热变性。
9.电泳后使用溴化乙锭(1) : 20000 溶解于0.5 X TBE 室温下，缓冲液中)染色5min， 在紫外线下观察RNA条带。
配方
复性缓冲液(10 X )
| 试剂 | 数量(100mL) ) | 终浓度( 10 X) |
| 乙酸钾( 2mol/L ) | 50mL | 1mol/L |
| HEPES-氢氧化钾( KOH ) ( lmol/L, pH7.4 ) | 30mL | 300mmol/L |
| 乙酸镁( lmol/L) | 2mL | 20mol/L |
| 水 | 补足至100mL | |
| 储存在室温下。 |
非变性胶上样缓冲液(1) 0 X)
试剂数量(100mL) ) 终浓度( 10 X) Ficoll-400 15g 15% (m/V) Xylene cyanol FF 250mg 0 25% (m/ V) 溴酚蓝 250mg 0 25% (m/V) 水 补足至100mL 分装为LML， -20 ℃ 储存。
