T载体是TA克隆载体的缩写，是利用载体的T端与PCR产品的A端连接，将目的基因克隆到载体中的一种方法。众所周知，基因克隆目的基因与载体相连，使目的基因能够在受体细胞中稳定遗传。有些朋友先克隆目的片段到T载体，然后酶切割连接目的载体，有些朋友直接将PCR产物酶切割连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体。那么TA克隆到底是多余的吗？相信很多朋友都有过这样的疑问。
无论你选择什么顺序的基因克隆，首先要说几个必不可少的步骤:PCR、酶切、测序。
1.PCR
回收同一管PCR产品后，将酶切割连接成克隆，筛选出几个PCR阳性克隆(菌液PCR鉴定)进行测序。大部分结果都是正确的，但有时发送测序的几个克隆有突变，反复测序也是如此。个人认为原因在于PCR产品的异质性。也就是说，同一管PCR产品中有很多产品，包括完全正确的(这部分可能占绝大多数)、突变的全长、微量或痕迹的不完全产品。如果PCR产品直接测序，则由于测序本身的原因，测序引物附近无法准确读取，可能会掩盖实际突变。如果这样连接到载体上，肯定会有一些错误。
2.酶切
PCR一般进行 使用菌液或基因组DNA的模板。菌液还好。如果是基因组DNA，一般提取的基因组DNA量不多，PCR量有限，然后酶切，酶切效率还存在问题。如果一个3k的片段使用25个高保真酶循环并不容易或获得产品（不多），但如果使用该产品进行两次PCR，可以说几乎所有的片段都有突变。当然也可以先PCR 10个循环，再进行2次PCR，突变可能会少一些。但是要探索两次PCR的PCR条件。如果模板用完了，得不偿失。如果T连接是在第一个获得PCR产品时进行的，T连接成功后进行测序，如果正确，然后从质粒中进行PCR，则突变的概率远低于从低复制模板（如CDNA）中进行的PCR。在时间和金钱上使用T载体是合理的。
3. 测序
PCR产物酶切割后连接，进行克隆测序。如果连接到T载体测序，则酶切割正确后连接到一个测序，至少需要两次车辆。一个测序至少需要4天，如果两个测序来回延迟很多时间，那就太耗时了。
如果是SNP，我觉得可以用PCR测序。虽然我上面提到的可能会有一些突变，但是SNP应该以量取胜。也就是说，当样本量超过N时，对最终结果分析影响不大。
工欲善其事，必先利其器！磨刀不误砍柴工！ 毕竟，无论片段有多难，你都不能保证，PCR－酶切－连接－所有的测序都可以一次成功。一般克隆，PCR可以直接连接。但在某些情况下，使用T载体可能更好，PCR产量低，模板珍贵，二次PCR突变多，可以使用T载体。毕竟T载体的连接效率比较高。虽然后者有点麻烦，但更稳定。这两种方法各有优缺点，大家根据自己的实验慎重选择！！！
