该方案描述了如何使用Northernn 杂交检测15~150 核昔酸小RNA 。总RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 再采用半干法转膜。RNA Church通过紫外线辐射交联到尼龙膜上 RNA在缓冲液中 和α-32用磷酸成像分析技术杂交标记的寡核昔酸探针(phosphorimager analysis) 检测分析。StarFire探针包含两个结构域，可以提高杂交探针的放射特性。StarFire 探针5′ 端的结构域可以与目标小RNA具有特异性 杂交， 3 ＇端结构可以携带10个 5个脱氧胸腺嘧啶核苷′ 在StarFirerere中，端寡聚核苷酸相互结合 探针的3′ 可与DNA形成端形成 聚合酶相互结合的10 [α-32p] 脱氧腺苷。
试剂
丙烯酰胺:双丙烯酰胺(19) : 1, 40%, m/ V)
[ α-32p]dATP (6000Ci/mmol,10mCi/mL)
硫酸按(10%， m/ V)
Church 缓冲液
甲酰胺上样电泳缓冲液<A>
[γ-32P]ATP (6000Ci/mmol,≥ 10mCi/mL)
miRNA StarFire 核酸标记仪(DNA 合成技术）
StarFire 探针( 50 个核苷酸以上， 聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化)
StarFire 通用模板(高效液相层析)
StarFire 10X 混合缓冲液( 100mmol/L Tris 7.5, 50mmol/L MgCl2, 75mmol/L DTT )
StarFire 终止缓冲液( 10mmol/L EDTA )
Exo- Klenow DNA 聚合酶
RNA 样品和5’端32P-RNA的放射性标记 分子质量标准
SDS (20%, m/V)
SSC （1 X, 20 X)
寡核苷酸合成探针( DNA 、RNA 或LNA-modified DNA)
T4 多聚核苷酸酶( 10U/μL)
T4 多聚核苷酸酶缓冲液(10 X)
TBE 缓冲液( 5 X 和0.5X)
TE 缓冲液( pH 8.0 , 10 X 和1 X)
TEMED (四甲基乙二胺)
尿素
图1 小RNA Northern 杂交流程图。
设备
印刷滤纸(加厚)、加热模块（ 95 °C)、杂交箱、杂交管、磁搅拌器、带正电荷尼龙膜、磷酸成像仪、磷酸成像板、聚丙烯酰胺凝胶装置Saran 保鲜膜、半干法转膜设备
方法
制备变性聚丙烯酰胺凝胶
1.配制含8 mol/L 尿素的15 ％变性聚丙烯酰胺凝胶
TBE 缓冲液(5X) 2mL 丙烯酰胺：双丙烯酰胺：双丙烯酰胺( 19 : I, 40%, m/V) 3.75mL 尿素 4.8g 去离子水 至10mL
2 . 在室温下，用磁性搅拌器搅拌溶液，直到尿素完全溶解。
3 确定胶水规格，组装胶水设备。
4 加入100μL10% ( m/ V) 按过硫酸。
5 加入10μL (TEMED) 四甲基乙二胺。
6 快速混合溶液并灌胶，插入10 孔梳子。室温下聚合20min 。
样品制备及电泳
7 将5 ~ 10μg 的总RNA 样品与上样缓冲液等体积混合， 终体积为10μL 。
8 95℃ 加热5min， 冷却在冰上。
9 清洗胶孔去除尿素，确保条带一致整齐， 然后上样10μL/孔必须设置含10的孔 X 5’端32P－RNA的放射性标记 标准。按说明书使用T4 聚核苷酸激酶和[γ-32P] ATP 标记RNA分子质量标准，稀释200 倍， 使其适合小RNA 杂交检测。
10 用0.5 X TBE 缓冲液200V 电泳约1h, 直到溴酚蓝到胶底。
半干法RNA 转膜
11 根据胶水的大小，切割一个带正电荷的尼龙膜和两个加厚痕迹滤纸，浸泡0.5 X TBE 缓冲液在室温下浸泡10min 。
12 将预浸泡过滤纸放在铅阳极，用塑料移液管排出气泡。
13 在印刷滤纸上放一层提前浸泡的膜， 并排气泡。
14 将胶水小心地转移到第一层膜上，并排出气泡。
15 将另一张提前浸泡的印刷滤纸放在胶水上，并排出气泡。
16 将阴极与胶膜结合起来( sandwich stack) 连接并覆盖保护盖，恒压20V 转膜1h 。
17 转膜完成后，将湿膜放在滤纸上， 254nm 紫外线照射( Stratalinker; 120000μ交联RNAJ的自交联装置 至膜上。
18 将交联膜放入杂交管中， RNA 向内。加入20毫升。 Church 缓冲液，将杂交管放入杂交箱孵化1h， 37℃ 过夜旋转预杂交。
制备5’端32p－寡核苷酸探针放射性标记
19 长度相同的探针可以与小RNA相同 完全互补， 5端标记反应所用试剂：
无核酸酶的水 6μL DNA 寡核苷酸探针( 25μmol/L) 1μL T4 多核苷酸酶反应缓冲液(10X) 1μL T4 多核苷酸酶( 10 U/μL) 1μL γ-32P ATP ( 6000 Ci/mmol, ≥10mCi/mL) 1μL
20. 37°C 反应1h 。
21 根据使用说明书，使用Sephadex G 25 旋转层分离出未掺入的分析柱[γ-32P] ATP 。
制备3’端32StarFirere标记的Starfire 寡核苷酸探针(可选)
22 用1 X TE StarFireer溶解缓冲液 一般模板的浓度为12.5μmol/L 。
23 用1 X TE StarFireer溶解缓冲液 一般探针的浓度为1000 μmol/L 。
24. StarFiree用无核酸酶水 通用探针稀释0.5.5μmol/L 。
25 在0.5mL 以下试剂混合在微离心管中：
StarFire 缓冲液( 10 X） 1μL
StarFire 探针( 0.5μmol/L ) 1μL
StarFire 一般模板(12.5μmol/L ) 1μL
26 . 将溶液与移液器混合，然后95°C 加热1min 。
27 取出试管冷却至室温(约5min) 。短暂离心，收集试管底部的反应物。
28 加入6μL[α-32p] dATP ( 6000Ci/mmol, 10mCi/mL) 和1μL 的Exo-Klenow DNA 移液器轻轻吹混合聚合酶。
29 室温孵化2h， 加入40μL StarFire 缓冲液终止反应。
30 根据说明书，使用Sephadex G25 旋转层分析柱分离未掺入的旋转层分离[α-32p]dATP 。
杂交
31 预杂交后(步骤18 ) ，将5端添加到预杂交溶液中32p－探针或放射性标记的3端32p-StarFirere放射性标记 探针，孵育2小时 或者过夜。
32 杂交完成后，小心地将杂交溶液转移到50毫升 锥形离心管中，－20℃ 储存。
33 用30mL 1 x SSC 和0.1% （m/V) SDS 两次用混合液洗瓶。
34 用30mL 1 X SSC 和0.1% （m/V) SDS 混合液37 °C 洗膜10min， 重复洗两次。
35 使用Saran 保鲜膜封闭湿膜，放在磷酸成像板上过夜。
36 磷酸成像仪读取杂交信号，并使用相关软件进行分析。
小RNA不同样品 相对丰度分析
37 根据使用说明，使用ImageGauge 软件定量相同样品的原始杂交信号和背景信号，并从原始信号中减去背景信号，即获得小RNA 特殊杂交信号。
38. 500mL 0.1 % (m/V) SDS 煮膜10min，从印痕中剥离，( strip ) 用Sarann出探针。 保鲜膜关闭湿膜，放在磷酸成像板上过夜，检测探针剥离是否成功。如果信号没有完全消除，则需要重复此步骤。
39 将膜与内参特异性探针杂交(如样品中有一个小核RNA) 、tRNA 或5S 核糖体RNA ) ， 如上所述，该方法可检测各样品内参的特殊杂交信号。
40. 对目标小RNA 杂交信号通过内参特异性杂交信号进行标准化，不同样品的标准化值可用于比较目标小RNA 相对丰度。
中小RNA样品 绝对量分析
41 与目标小RNA订购 RNA的序列完全相同 将寡核昔酸序列稀释成一系列浓度(10-1~103fmol) 。
42 稀释RNA 从样品到变性聚丙酰胺凝胶的寡核苷酸和样品，如上述Northern杂交(步骤7)～步骤36) 。
43 绘制RNA 寡核苷酸稀释样品浓度与特定杂交信号（确保背景减少）之间的关系曲线，并比较两者之间的杂交信号以获得标准曲线。根据标准曲线确定中小型RNA 的绝对量。
疑难解答
问题（ 步骤36 ) ：信号没有检测到，但检测到了5′ 端32p 分子质量标准的放射性标记。
解决方案： 尝试以下方法。
．检查探针序列是否与待检测目标小RNA一起 完全互补。
．将探针用15 ％变性聚丙烯酰胺凝胶分离后，用磷酸成像仪检测探针是否完全标记。
．检查内参。
·为了提高灵敏度，使用5′ 端32p RNA的标记 寡核苷酸探针或5′ 端32LNA修改的DNA标记的LNA 寡核苷酸探针将温度分别升高至60 °C 或70 °C 。
问题（ 步骤36 ) ：背景杂交信号检测较高。
解决方案： 将预杂交延长到过夜。最后一次洗涤步骤重复两次或两次以上。
配方
T4 多聚核苷酸酶反应缓冲液( 1 0X)
试剂 体积(1mL ) 终浓度( 10 X) Tris-HCI ( 1mol, pH7.6) 700μL 700μmoL MgCl2 ( 1mol ) 100μL 100μmoL DTT ( 1mol ) 50μL 50μmoL H2O 150μL -20℃保存。
