一．样品制备
1．扩展和检测PCR。PCR扩展应根据不同的引物选择合适的退火温度。扩展产品采用2-2.5%琼脂糖胶水平电泳检测，上样量为3-5ul。PCR产品约为10ng/nl。
2．PCR产品与变性buffer混合。将5ul添加到干净的PCR管底部 SSCP上样缓冲液(变性缓冲液)，然后在缓冲液中心添加PCR扩增产品。根据经验，琼脂糖胶上可以看到亮带样品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好，适当增加1.5、2或3不等，同时增加样品缓冲液的量，如3ulPCR产品，8ul变性效果更好。
3．PCR产品变性。加好的样品离心，使样品集中在管底。PCR仪表95℃变性10分钟，立即取出PCR产品，与架子一起放在冰上静置5min，避免变性产品复性。
注：3和4步可在制作SSCP胶第四步后等待凝胶过程中进行。
- 制胶
甘油浓度为50%的几种大板胶(10ml下胶，5ml 浓缩胶配方(两块胶) 1.0mm）：
甘油浓度为50%的几种小板胶(15毫升下胶，10毫升 浓缩胶配方(两块胶) 1.5mm）
3．灌胶。配胶后搅拌均匀，倒入安装好的玻璃板中。注意不要产生气泡。如果产生气泡，将板立起，轻轻敲打，使气泡从胶面上升起。当胶面与凹板上缘差约0.5cm时，插入梳子，确保梳齿与液面接触处无气泡。一旦产生，应拔出并重新插入。
4．静置。灌胶平放或与水平形成较小角度(10o以下)静置水平桌面约30min，使其充分聚合。
注：PCR样品变性可在此时进行，即第一部分的3、4步。
- 上样
1.安全板。聚合后，及时拔出梳子（长时间延迟会使梳子难以拔出）。拔出梳子时，用力均匀，保持胶孔整齐。用夹子将胶合板固定在电泳池上，槽的一侧朝内。安装板时，首先将电泳液接触到板的底部一端，然后慢慢过度到另一端，以避免产生大气泡（大气泡会弯曲电泳带）。
2．预电泳。从底槽中使用一些电泳液1×TBE吸入上槽，使液位高于玻璃板短边1cm以上，保证上槽不漏液。打开电源，将大槽电压调整到140-150V，小槽110-120V，预电泳约10min。(0.1W/cm,10℃，1-3h)
3．点样。用微量进样器将准备好的样品按顺序添加到橡胶孔中。由于边缘效应带形状不整齐，最好不要点击每个板中最边缘的两个孔。
4．电泳。大槽电压140-150V，小槽110-120V，温度10-15℃，恒温电泳10小时以上。
- 染色
1．固定。卸下胶水，做好起始标记，将其放入70%乙醇中，在摇床上固定15min。固定后，乙醇回收（可重复使用5次左右），蒸馏水洗两次，每次3min左右。如果同时染上两块胶水，应适当增加固定和洗脱时间。
2．染色。染色液(200毫升染色液含有3.6%NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml)染色30min，同时染两块胶需要40min左右才能适当增加时间。倒入染色液，洗3次，每次3min，同时染两块胶，适当增加时间。
3．显色。显色液(200ml显色液含1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul)清晰。倒出显色液，加蒸馏洗脱3次。
(也可将凝胶浸泡在其中 0.5ug/ml溴化锭1×在紫外线下观察TBE缓冲液染色10min)
附录
- 甘油浓度为50%的几种大板胶(10ml下胶，5ml 浓缩胶配方(两块胶) 1.0mm）：
- 2. 甘油浓度为50%的几种小板胶(15毫升下胶，10毫升 浓缩胶)配方(两块胶5mm)
3．10×TBE配方：
108g Tris碱、55g硼酸，40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容1L
4.变性buffer配方
98%去离子甲酰胺，10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯FFF、0.025%溴酚蓝
注意事项：
①重复性。影响SSCP重复性的主要因素是电泳的电压和温度。 SSCP图谱可以保持良好的重复性。一般来说，SSCP图谱是两条单链DNA带，但有时是一些DNA片段 也许只有一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是因为两个单链DNA之间有相似的三维图像。有时超过三个SSCP图谱是由于野生DNA片段和突变DNA片段的共同结果.
②目标DNA序列长度的影响发现，SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率高于长链，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的变化在维持三维图像中的作用较小。有些人认为，DNA的长度不会影响DNA链较短（低于400bp）的SSCP 的效果.
③电泳电压和温度的影响：SSCP应处于较低温度，以保持单链DNA的稳定立体结构 度下(一般在4℃-15℃之间).在电泳过程中，除了环境温度外，过高的电压也是温度升高的主要原因。因此，当SSCP在没有冷却装置的电泳池上进行时，最初的5min应用程序相对较高 高电压(250V)，以后用100V左右的电压电泳。这主要是因为初始高压可以初步分离不同立体构象的单链DNA，凝胶温度不会升高。随后的低压电泳可以使用 进一步分离。电泳电压应根据实验中的具体实验条件确定.
④SSCP的结果表明，非变性PAG电泳不是基于单链DNA分子和带电量 分离的大小是单链DNA片段空间构象的三维阻力大小。因此，这种分离不能反映分子量的大小。有时正常链的迁移率非常接近突变链，很难看到两者之间的区别。因此，一般要求电泳长度为16–18cm以上，结果以检测限为指标确定。检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段之间可分辨的电泳距离差的最小值。如果大于检测限制，则确定链的迁移率发生变化，表示DNA序列发生变化，如果小于检测限制，则表示链之间没有变化。例如，一般检测限制为3mm，当两条带之间的距离超过3mm时，则表示两条链之间发生了变化。此外，检测限制不能设置得太低，否则主观因素太大，容易造成假阳性结果。此外，SSCP 对PCR产品的上样量、PAG的交联度、胶水的浓度等其他条件进行分析 选择和确定体验.
