转染方法:
将基因导入真核细胞的方法可分为三类:转移生化方法、物理方法和病毒介导。
转染法的选择取决于以下实验要素:
.最终目的是基因表达还是蛋白质生产
.细胞类型(贴壁细胞或悬浮细胞,适合培养的细胞或原代细胞)
.细胞系抵抗转染压力的能力
.筛选方法的类型
.培养条件
.核酸类型的转染( DNA 、RNA 、siRNA 或寡核菩酸)
.系统所需的效率
.低、中、高通量要求
瞬时转染和稳定转染
将DNA 有两种不同的方法可以导入真核细胞:瞬时转染和稳定转染。在瞬时转染中,DNA重组 导入易感细胞系,目的基因产生短暂但高水平的表达,DNA转染 宿主染色体不一定整合。当需要在短时间内分析大量样品时,瞬时感染是首选。一般情况下,转染后1 ~4 天收获细胞,获得的细胞裂解物用于检测目的基因表达。
用于建立克隆细胞系统的稳定或永久性转染。此时,转染的目的基因整合进入染色体DNA,指导目的蛋白的合成,表达量通常为中等。一般来说,形成稳定转染细胞的效率比瞬时转染低1 ~ 2 个数量级。可选的遗传标记有利于从大量未转染的细胞中分离出少数稳定的转染体。标记基因可以存在于携带目的基因的重组质粒上,也可以通过共转染和重组质粒在另一个单独的载体上导入所需的细胞系。


