1.培养基从细胞单层吸出。
2. 缓慢加入37’C PBS温浴 或者不含血清的培养基沿容器壁流下，注意不要滴在细胞上，以免冲走附着不牢的细胞。
3. 再次吸出PBS 或培养基。
4. 加入含0.25 ％PBS，胰蛋白酶， 刚才没有细胞加入蛰是合适的。
5. 立即吸收胰蛋白酶，在细胞上停留10次 ~ 30s(不含血清的旧培养基可以多次清洗细胞，以去除血清的痕迹，血清的存在会抑制胰蛋白酶的活性)
6. 室温放置5 – 15 min, 观察容器摇晃时单层细胞是否每隔几分钟滑动一次。如果是，可以进行下一个实验。如果没有，可以是37°C 保温5 min 。
7. 在倒置显微镜下确认游离的单个悬浮细胞是通过添加新鲜的培养基和开始时的体积，并吹打细胞分散细胞。
8. 吸出1 ml 细胞悬浮液在微离心管中。
9. 计数细胞。
10. 计算推荐培养浓度的稀释倍数。
11. 将适量细胞吸出到新的培养瓶中。
12. 加入适量3 7°C 新的培养基。
13. 轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分散在表面。
14. 将细胞放入培养箱，拧松盖子。
（tip: 如果你使用100 cm 培养皿，注意区分组织培养皿和细菌培养皿，细胞不能附着在未经处理的细菌培养皿上。)
eg: 细胞计数得到1.0 X 106 细胞／ mL, 种子液浓度为105 细胞／ ml, 最终细胞液体积为10 ml, 那么原液必须稀释10 倍，也就是1 ml 将原液添加到9毫升 在新培养基中。
