浅析细胞转染效率低下的原因

细胞转染效率低的主要原因是：

1、细胞太少或细胞密度太大

细胞密度对感染效率有一定的影响。不同的转染试剂需要不同的细胞密度。即使是相同的试剂也会因不同的细胞类型或应用而异。细胞密度过高或过低会导致转染效率降低，甚至表达水平较低。因此，如果选择新的细胞系统或新的转染试剂，最好优化实验，为以后的实验建立稳定的方法，包括适当的接种量和培养时间。

阳离子脂质体具有微量的细胞毒性，通常需要更高的铺装密度或更多的悬浮细胞。有些细胞需要90%的聚合物；一些多胺或非脂质体的配方需要在40%-80%之间，尽量在细胞最适宜的生理状态下转移，以达到最佳的转移效果。

2、电压过大

电转时，如果电压过大，细胞往往会大量死亡。不同的细胞需要不同的电压。

3、未加血清

血清曾被认为会降低感染效率。老一代的感染方法通常需要在没有血清培养基的情况下清洗细胞或感染，但一些敏感细胞，如原始细胞，会受损，甚至死亡，导致感染效率极低。然而，如今，经过几次创新，血清的存在不再影响主流转染试剂的转染效率，甚至有助于提高阳离子聚合物等转染效率。

如果感染后不及时添加血清，会导致大量细胞死亡。一般情况下，应在感染后4-6小时内更换液体，并更换为血清培养基。血清也可以滴入原来的无血清培养基中。

4、细胞污染

细胞污染也是细胞死亡和转染效率低下的主要原因。首先，用于转染细胞的质粒必须无菌。目前，市场上的一般质粒提取试剂盒不能绝对无菌。

如果同一实验室同时培养不同类型的细胞，即使遵循最严格的分离操作程序，也可能发生交叉污染。

5、 构建转染载体

构建转染载体(病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产品、寡核苷酸等。)也会影响感染结果。病毒载体对特定宿主细胞的感染效率较高，但不同的病毒载体有其特定的宿主，有些还需要特定的细胞周期，如逆转录病毒需要感染分裂期的宿主细胞，并考虑一些安全问题（如基因污染）。除了载体结构外，载体的形状和尺寸对感染效率也有不同的影响，如上述超螺旋和线性DNA对瞬时和稳定感染的影响。如果基因产物对细胞有毒作用，就很难进行感染。因此，选择组成或可调节的启动子也非常重要。同时，空载体和其他基因相同载体的感染可以消除毒性影响的干扰。


转染质粒的数量首先要保证，一般为2μg以上。质粒纯度不足或含有细菌LPS或其他对细胞有毒的物质也会影响感染效率。此时，应纯化和浓缩质粒。

6、试剂毒性大

有时转染效率低是脂质体试剂毒性高的原因。推荐非脂质体转染试剂，如Entranster试剂。

7、不注意细节

转染前更换37℃预温培养基可提高转染效率。脂质体和DNA/RNA混合物应从培养皿的一侧滴到另一侧，轻轻摇动培养皿，以确保均匀分布，避免局部高浓度。这些都是细节，但如果不注意，也会导致转染效率低下。

8、细胞状态不好

有时细胞密度不当，转染时融合度应为70%-90%。细胞状态不佳会导致转染效率低下。一般来说，转染细胞应处于对数生长期。如果是贴壁细胞，贴壁率应为70-80%；如果是悬浮细胞，应该是6X105个/孔(24孔板)，一般是感染前一天换液，感染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。