一、试剂
完全培养基，DMEM 胎牛血清的培养基和胎牛血清（FBS)、慢性病毒载体储备液、多聚甲酸( 4%) （ 可选；见步骤15)、青霉素／慢性病毒滴定试剂盒链霉素溶液( P/S ) （100 ×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺(海美溴铵) ( 8mg/mL) 、QuickTiter (与慢性病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞，胰蛋白酶－EDTA ( 0.05% )、UltraRapid 慢性病毒滴度测定试剂盒(可选)见步骤23 )
二、设备
12 孔培养板、流式细胞仪、血细胞计数器、恒湿细胞培养箱(37℃， 5%CO2)、倒置荧光显微镜、微量移液器配备观察荧光蛋白滤光片，可读450nm 微孔板酶标仪，带无菌滤芯的移液器吸头(20μL 、200μL 和1000μL)、无菌试管(1.5mL)
有限的稀释法测定病毒滴度
该方案仅适用于293T 慢性病毒在细胞功能启动下表达绿色荧光蛋白。
1 滴定实验前1 天，向12 孔板上含有LML 完全培养基的每孔接种3 X 105个293T 细胞。轻轻摇晃倾斜板，确保细胞均匀分布。板上只有一种慢性病毒载体储备液。37 °C 、5% CO2在细胞培养箱中培养过夜。
2 第1 天，用0.5 mL 37°C 预热的、含8 μg/mL 聚凝胺（1 : 1000 稀释8mg/mL 聚凝胺储备液)完全培养基更换孔中的完全培养基。
3 慢性病毒载体用完全培养基连续稀释:对于非浓缩储备液，1 : 10 、1 :102和1 :103稀释；对于浓缩储备液，1 : 102 、1 : 103 、1 :104和1 : 1 矿物稀释。每孔加5μL载体稀释液，重复3 次(每次稀释3 孔） 。非浓缩储备液还包括一组5μL 原液孔。37 °C 培养箱进行培养。
4 第2 天， 加入37 °C 预热的0.5mL 完全培养基。在细胞培养箱中培养2 天。
5 第4 天，小心地去除每个孔中的完全培养基，并添加LML PBS 。
6 倒置荧光显微镜配备观察绿色荧光蛋白滤光片，10 在倍物镜下计数每个视野的克隆数。每个视野中有1个选择 ~2 0 克隆的稀释度。每孔稀释度随机计数5 个视野(3 孔X5 视野／孔＝ 15 计算个观察视野)。计算平均克隆数。／观察视野后，滴度按以下公式计算
滴度(TU/mL) = (N× C× D) /0.005
式中， N 平均克隆数／观察视野； C 视觉面积除以孔洞面积； D 稀释载体储备液的倍数。
首先确定观察视野的直径(FOVϴ) ，也就是说，目镜的视野数(这个值通常写在目镜的一侧，例如， 22对应22mm ) 除物镜放大倍数(如10)外 ，然后使用公式和面积＝ π × (FOVϴ/2)2 计算观察视野面积。
流细胞仪测定滴度
7 准备滴定用293 T 细胞，具体步骤1 。在12 除准备必要数量的孔外，孔板上还应增加3个孔 个孔。
8 第1 天，对3 细胞计数孔。用1ml抛弃完全培养基 PBS 洗涤细胞，加0.5mL 0.05 ％胰蛋白酶－EDTA, 在室温下孵化5min 。加0.5 mL 完全培养基完全混匀细胞后，细胞悬液转移到1.5mL 在试管中，用血细胞计数器确定细胞浓度。计算每个孔细胞的平均值。
9. 按照步骤2~4 进行滴定。
10 在第4 天，弃去完全培养基，用1毫升 PBS 清洗细胞，添加0 . 5mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA, 在室温下孵化5min 。
11 每孔加0.5mL 将细胞悬液转移到1 .5 mL 试管中。
12 室温下以500g 离心细胞5 min 。吸收完全培养基后，使用1mLPBS 重悬细胞。
13 再次在室温下500克 离心细胞5min 。抛弃完全培养基，使用1 ~2mL PBS 重悬细胞。
14 荧光阳性细胞的百分比由流式细胞仪确定。
如果1h 内部不进行分析， 用4％多聚甲醒－PBS 固定细胞30min， 再用PBS 在PBS洗涤 中4 ℃ 储存。
15 滴度按以下公式计算(TU/mL)
滴度(TU/mL) = (N× F× D ) /0.005
式中， N 为第1 每天孔细胞平均数； F 是荧光细胞的百分比； D 稀释载体储备液的倍数。
DNA转导细胞基因组 PCR上载体基因组 测量滴度
16 . 按步骤1 ~4 进行。
17 第4 天，弃宪全培养基，每孔1mL 的PBS 洗涤细胞，每孔加0 .5mL 的0.05 %胰蛋白酶－EDTA, 室温孵化5min 。
18 . 每孔加0.5mL 完全培养基，重悬细胞。将细胞悬液转移到1.5mL 试管中。
19 室温下500g 离心细胞5min 。弃培养基，用1mL 的PBS 重悬细胞。
20 再次在室温下500克 离心细胞5min 。
21. 从转导细胞分离基因组DNA中使用商业化试剂盒， 基因组DNA的测定 浓度。
22 使用定量PCR 在每个靶细胞二倍体基因组上确定慢性病毒载体的复制数( Kutner et al.2009) ，也可以按照使用说明书(省略步骤18) ~ 24) ，基于定量PCR的使用 Ultrarapid 慢性病毒滴定试剂盒。
23 慢性病毒载体滴度按以下公式计算
滴度(TU/mL) = (N × C× D) /0.005
式中， N 是第1 每天孔细胞平均数； C 是慢性病毒载体在每个二倍体基因组中的复制数； D 稀释载体储备液的倍数。
ELISA 测定p24 以确定滴度的浓度
另一种基于转导试验的方法是使用ELISA HIV-1 p24 的浓度。
24. OptiMEMEM用于非浓缩慢性病毒载体储备液 进行1 : 10 和1 :102稀释，每次稀释重复测定3 二。OptiMEMEM用于浓缩慢性病毒载体储备液 进行1 :102、1 :103和1 : 104 稀释，每次稀释重复测定3 次。
25 使用Quicktiter按照使用说明书使用 慢性病毒滴定ELISA 试剂盒测量了慢性病毒载体储备液中病毒颗粒的P24 的浓度。
