Q1：如果慢性病毒载体中没有抗性标记，只有GFP，能否筛选稳转细胞代代培养？
A1：流式分选是流式细胞仪的一种功能，可以使用流式细胞仪。一般实验室对流有专人操作，不需要自己动手。由于缺乏抗性，需要注意分选过程中的无菌操作。
Q2：RNA干扰如果用慢病毒做稳转细胞株，什么样的目的RNA可以用来干扰稳转细胞株？目的RNA编码蛋白的作用是否与稳转有关。如果能稳转，筛选过程需要多长时间？
A2：当然，并不是所有的MRNA都适合建立稳定的细胞株，有两个前提，一个是细胞可以稳定存活，另一个是稳定干扰的MRNA。这两个前提必须同时存在才能被视为成功。换句话说，如果MRNA被干扰，细胞就不能存活或稳定地继承，自然就不能建立这样一个带有RNAI的稳定细胞株。
Q3：准备与TRANSWELL混合培养基因沉默的贴壁原代细胞和另一个正常的贴壁细胞。混合训练时间最长为48小时。选择SiRNA 还是shRNA好？
A3: SiRNA可以选择，因为RNA需要在48小时内生成，所以最重要的是转染效率足够高。
Q4:为癌干细胞RNA干扰前后的细胞生物学行为做准备是SiRNA 还是shRNA 效率好呢？
A4: 仅就SiRNA和ShRNA的干扰效率而言，没有区别；但是你应该考虑转染效率；因为最终效果=干扰效率*转染效率*各种操作引起的衰减。换句话说，shRNA可以用来筛选，可以保证100%的细胞是KD，所以positive的结果会更明显。SiRNA会削弱或叠加实验结果，因为转染效率和细胞毒性的提高。如果你的靶蛋白功能非常强大和不可或缺，可能会有明显的差异；而且SiRNA的成本很高。ShRNA的缺点是体内的许多基因功能是互补的，所以一个功能非常重要的基因可能有多种互补的方式，经过长期筛选，表衰减甚至没有表；但成本低，模型稳定。所以互有优缺点，但shRNA通常是首选，siRNA主要用于紧急或互补。
Q5: SiRNA转染，48小时提取RNA，72小时提取蛋白质，发现RNA水平和蛋白质水平没有沉默效果。我不知道出了什么问题？阳参也没有沉默效果。荧光对比显示，转染效率相当高。测试时间需要优化吗？还是设计顺序有问题？
A5:测试时间问题不大。阳性对照为阴性，说明实验过程或阳性对照本身存在问题。需要注意的一个问题是，如果带荧光的SiRNA只附着在膜上而不进入细胞，在荧光显微镜下看到整个细胞都是荧光，就会误以为转染效率很高。一些脂质体转染试剂，如lipo2000，通常会通过膜融合将核酸带入细胞。
Q6: 慢性病毒介导RNA干扰基因的表达，稳转细胞筛选方法
A6: RNAi稳转细胞筛选类似于DNA稳转细胞筛选，如抗性标志、抗性药物筛选等。
Q7:最近在做RNAI，是找公司做的质粒载体，共有四个载体，转染后收集细胞提取RNA做RT-PCR,但没有干扰效果，阳性对照是干扰GAPDH也没有干扰效果。我该怎么办？ ?
A7: 如果转染效率没有问题，阳性对照为阴性，说明:1。转染实验和操作没有问题。2.RT-PCR有结果，RT-如果PCR没有被污染，过程中应该没有问题。3.质粒载体问题的可能性很大。建议:只转阳性对比，进一步确定问题。
Q8: 如果我只想筛选干扰的有效序列，是否有必要建立G418稳定细胞系？只做瞬转可以吗？
A8: 通过westernblot或qrt-PCR筛选有效序列，即可确定瞬转siRNA。
