(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；(2)用于基因组学和细胞信号传输通道分析；(3)用于药物靶点筛选和疾病治疗。
实验方法原理：
大多数SiRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)其中一个，操纵一个小发夹RNA(shorthairpinRNA, shRNA)哺乳动物细胞中的表达。这三种启动子包括熟悉的人源和鼠源的U6启动子和H1启动子。RNA之所以被使用 poliII启动子是因为它能在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，并且通过添加一串(3到6个)U来终止转录。要使用此类载体，需要订购DNA单链、退火、克隆两段编码短发夹RNA序列到相应载体的pol III 启动子下游。由于克隆需要几周甚至几个月的时间，也需要测序，以确保克隆的顺序是正确的。
实验步骤：
一、确定目的基因
1.检索文献获取有效的靶点序列(验证)。
2.NCBI查阅：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
二、设计siRNA靶序列
在制备SiRNA之前，需要单独设计SiRNA序列。研究发现，对于哺乳动物细胞来说，最有效的SiRNAS是一个双链RNA，有21-23个碱基大小，3端有两个突出的碱基；对于非哺乳动物来说，长片段DSRNA更有效。SiRNA的序列专一性要求非常严格，与靶MRNA的碱基错配会显著削弱基因沉默。
1.选择SiRNA靶点
从转录AUG开始，搜索下游AA序列，记录每个AA 三端相邻的19个核苷酸作为候选人的SiRNA靶点。研究结果表明，GC含量在30%-50%左右的SiRNA比GC含量高的SiRNA更有效。建议在设计siRNA时，不要针对5‘和3’端的非编码区域（untranslated regions,UTRs），原因是这些地方有丰富的蛋白质组合区域，这些UTR组合蛋白或翻译初始复合物可能会影响SiRNP核酸内切酶组合MRNA，从而影响SiRNA的效果。
2.序列同源分析
将潜在的序列与相应的基因组数据库(人或小鼠、大鼠等)进行比较，排除与其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)选择合适的目标序列进行合成。并非所有合格的SiRNA都同样有效。原因尚不清楚，这可能是位置效应的结果。因此，对于目标基因，SiRNA通常需要选择3-5个目标点进行设计。一般来说，每个目标序列设计3-4对sirnas，选择最有效的后续研究。
3.设计阴性对照
一个完整的SiRNA实验应该有阴性对照。作为阴性对照，SiRNA应该与选定的SiRNA序列相同，但与MRNA没有明显的同源性。通常的方法是打乱所选SiRNA中的碱基序列。当然，我们也应该确保它与其他基因没有同源性。
三、表达载体的选择
1.化学合成和体外转录方法是在体外获得SIRNA后导入细胞，但这两种方法主要有两个不可克服的缺点：SIRNA进入细胞后容易降解；细胞内进入细胞SIRNA的RNA效应持续时间短。鉴于这种情况，SIRNA在质粒和病毒载体介导下的表达。该方法的基本思路是将SiRNA对应的DNA双链模板序列克隆到载体RNA聚合酶II的启动子中，从而在体内表达所需的SiRNA分子。这种方法的总体优点是不需要直接操作RNA，可以达到长期的基因沉默效果。
2.通过质粒表达SiRNAS主要是Poll III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。PoliII启动子之所以被选中，是因为它总是在离启动子的固定距离转录合成RNA，遇到4-5个连续U就终止，非常精确。有Pol的时候 III 当启动子和shRNA模板序列的质粒感染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能降低特定基因的表达，抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点是，SiRNA载体可以更长时间地抑制目的基因表达，通过SiRNA表达质粒的选择标记。当然，另一点是，与其他合成方法相比，质粒可以复制和扩展，这可以显著降低制备SiRNA的成本。
3.具有抗生素标记的SiRNA表达载体可用于长期抑制研究。通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达几周甚至更长时间。同时，RNAi-Ready表达载体也可以与逆转录病毒和腺病毒表达系统集成（BDKnockout RNAi Systems），它是实现哺乳动物细胞SiRNAS瞬时表达和稳定表达的理想工具，大大提高了SiRNA表达载体对宿主细胞的感染性，彻底克服了部分细胞感染效率低下的障碍。
四、合成模板
1.DNA合成编码shRNA 模板的两个单链与RNA相连 PolyII聚合酶转录中止点，BamH分别设计在两端 I 和Hind III 酶切位点可以克隆到SiRNA BamH载体多克隆位点 I 和Hind III 酶切位点之间。
2.95℃，5 min，缓慢退火，DNA shRNA是单链获得的 的DNA 双链模板。
五、连接与转化
1.将100μ感觉状细胞在冰上解冻。
2.取5μl 将产品连接到感觉细胞中，用混合的内容物轻轻旋转几次，在冰上放置30分钟。
3.将管道放入预加热至42℃的水浴中，加热90秒。迅速将管道转移到冰浴中，冷却细胞1~2分钟。
4.每管中加700 LB培养基，37℃振荡培养1小时，复苏。
5.室温4 000 rpm离心5分钟，弃去上清后，剩下100μL培养基重悬细胞，并将其涂抹在含有抗性的LB琼脂平板表面。注：细胞用量应根据连接效率和感觉状细胞效率进行调整。
6.将平板放置在室温下，直到液体被吸收。
7.倒置平盘，37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
六、PCR鉴定和测序鉴定
DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，插入编码SHRNA，扩展片段在100-200bp之间。
注意事项：
如果计划合成SiRNA，可以直接提供以AA为主的21个碱基序列，厂家会合成一对互补序列。需要注意的是，合成的SiRNA通常以3‘DTDT结束，如果要UU结束，通常需要特别说明。结果表明，UU结束与DTDT结束的SiRNA在效果上没有区别。因为这个突出端不需要补充靶序列。
其他：
1.sirna操作成功的关键点
1. 设计每个基因，检测两到四个siRNA序列
扫描靶基因中的AA序列，以找到潜在的靶点。记录每个AA 3端19个核苷酸作为潜在的SiRNA靶点。通过GENBANK数据库的BLAST分析，可以去除与其他基因明显相同的靶点。如果可能的话，SiRNA应该根据MRNA的低二级结构进行区域设计。
2.选择低GC含量的SiRNA
研究发现，GC含量为40-55%的SiRNA活性高于55%。
3.纯化体外转录SiRNA
感染前确认SiRNA的大小和纯度。为了获得高纯度的SiRNA，建议将玻璃纤维结合起来，洗掉或通过15-20%的丙烯酰胺胶去除反应中多余的核苷酸、小寡核苷酸、蛋白质和盐离子。注：化学合成RNA通常需要胶水电泳纯化（即PAGE胶水纯化）。
4.避免RNA酶污染
微量RNA酶会导致SiRNA实验失败。因为RNA酶在实验环境中很常见，比如皮肤、头发、所有徒手接触或暴露在空气中的物品……所以保证实验的每一步都不被RNA酶污染是非常重要的。
5.健康的细胞培养物和严格的操作，以确保重复感染
一般来说，健康的细胞感染效率较高。此外，较低的代数可以确保每个实验中使用的细胞的稳定性。为优化实验，建议使用50代以下的感染细胞，否则随着时间的推移，细胞感染效率会显著降低。
6. 避免使用抗生素
抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。一些细胞和转染试剂在SiRNA转染时需要无血清。在这种情况下，正常的培养基和无血清培养基可以同时进行比较实验，以获得最佳的转染效果。
7.选择好的转染试剂转染SiRNA
对于靶细胞类型，选择良好的转染试剂和优化操作对于SIRNA实验的成功至关重要。SIRNA实验要求选择适合小型RNA的转染试剂。
8.通过适当的阳性对照优化转染和检测条件
对于大多数细胞来说，看家基因是更好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照SiRNA转移到靶细胞（也适用于实验靶SiRNA），并在48小时后计算与未转染细胞相比，对照蛋白或MRNA的降低水平。过多的SiRNA会导致细胞毒性甚至死亡。
9.通过阴性对照SiRNA排除非特异性影响
适当的阴性比较可以通过扰乱活性siRNA的核苷酸顺序来设计。必须注意的是，它应该进行同源比较，以确保相对需要研究的生物的基因组没有同源性。
10.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的SiRNA可以用来分析SiRNA的稳定性和传染效率。标记的SiRNA也可以用作SiRNA的内部定位和双标记实验(配合标记抗体)来跟踪传染过程中导入SiRNA的细胞，将传染与靶蛋白表达的减少相结合。
