EB 病毒的特点之一是能使人外周血B 淋巴细胞的转化使其成为淋巴母细胞样细胞，即永生细胞，即永生细胞。每一个永生细胞株都保留了原本提供血样个体的完整基因组，为研究世界上不同种族、不同民族的遗传结构、不同个体、不同人群对疾病的易感性，特别是家族遗传疾病和地方疾病的易感性提供了宝贵的遗传资源。
(一)材料和设备
1. 无菌材料 T25细胞培养瓶 、T75, 冷冻管、一次性小滤器、一次性离心管15ml 、50ml, RPMI1640, 青／胎牛血清，链霉素，肝素， HEPES, 淋巴细胞分离液，环抱素A， EB 病毒， PHA, 二甲亚啶，冻液，防护手套。
2. 设备 二级无菌操作柜，CO2 培养箱、4℃ 冰箱、－20℃ 冰箱、－70 °C 冰箱，离心机。
(二)实验步骤
1 ．静脉取血3~4ml，等量RPMI1640 (每毫升培养液含青霉素100U/链霉素1000μg) 稀释血液，混合均匀。
2 . 15ml 加4ml离心管 淋巴细胞分离液，将稀释的血液慢慢加入淋巴细胞分离液液表面。
3. 离心，每分钟2500 转离心30min，或每分钟3000 转离心25min。
4. 淋巴细胞分离液液表面有一层白膜(即淋巴细胞)，轻轻吸出白膜层。移入15毫升 离心管内。
5. 用RPMI 1640 (每毫升培养液含青霉素100U/链霉素1000μg) 清洗3 次。
6. 第三次清洗后，弃去上清液轻轻悬起细胞，加2ml RPMI1640完全培养液，1.2ml EB 病毒、0.4ml 环玸素A 、0.2mlPHA 将细胞轻轻混合，然后分为2 个细胞培养瓶， A、B 培养两条线， 37°C培养箱，不需要CO2
7. 24h 在后镜下观察， 如果细胞明显增大并聚，悬浮生长，则表明细胞转化成功。
8 ．每隔1~2d 当瓶内培养液量达到2/3时，少量补液 从培养瓶中取出体积的1/2，需要半量换液 丢弃或多一点的培养液，加入等量的完全培养液。
9 ．当细胞量达到1时，细胞冻存 x107每个冷冻管细胞的量为1 x 106~ 1.2×106。冻存前1d 需要更换新鲜的培养液。
10 . 将细胞放入冷冻管后， 用棉花包裹冷冻管约2 寸厚放入－70℃冰箱， 24小时后放入液氮罐中。
（三） EB 病毒的制备
1. 复苏B-958 细胞， 37℃ 水浴解冻， 用10ml PBS 洗1 二、弃去上清液。
2 . 溶解细胞 8ml 的RPMl1640 在T25中接种宪全培养液 在细胞培养瓶中。
3 . 每隔1 ~2d 补充一定数量的培养液， 饥饿4~7d，直到达到所需的毫升， 收集上清液。
4. 于－70℃及37℃ 反复冻融3 次。
5. 以每分钟1500 转速离心15min 。
6. 过滤( 0.22μm ）。
7. 分装1.5~ 10ml,，-70 ℃ 冰箱储存备用。
(四)试剂的准备
1 . 抗生素的制备 青霉素和链霉素， 一般配制浓度为10000U/ml 和10 000μg/ml ，用无菌的D-hanks 溶液或生理盐水溶解，分装小瓶， 5ml／瓶，－储存20℃冰箱备用。每11次使用时间。 00ml 培养液加1ml 双抗(每毫升培养液含有100U音霉素/1000链霉素μg )
2 . 抗凝药 一般每毫升全血加25UU 肝素抗凝。市售肝素每2毫升。 取肝素0.4，含12500Uml (2 500U) 将无菌生理盐水加入10毫升 (浓度为250U/ml ), 分装， 放4℃ 冰箱保存备用。每毫升全血加0. 1ml 浓度为250U/ml 的肝素。
3. 1mo/L HEPES 称HEPES 粉末23.85g, 溶解在80ml 三蒸水中， 使用1mol/LNaOH 调pH 至7.0, 定容至100ml ，过滤除菌，分装小瓶， 保存4℃冰箱备用。
4. 环孢素A 每支5ml 含250毫克。5毫升 环孢素A 分装小瓶，放4℃ 冰箱储存备用。使用时取20。μl 原液加50毫升 的RPMI 1640 内，配成20μl/ml ，分装0.4~0.8ml 一管， -20℃ 冰箱储存备用。
5. PHA 进口试剂、国产试剂均可， 10mg PHA, 加5毫升生理盐水 溶解， 分装小瓶， 4℃冰箱储存备用(使用浓度为500μg/ml ) 。
6. 胎牛血清 Gibco 或者Hyclone 公司生产的优质胎牛血清， 56℃灭活30分钟 。
7. RPMI1640 RPMI完全培养液的准备 1640 、15％胎牛血清、1％双抗，18mmol/L HEPES 。
8 . 用培养基准备转化 2ml RPMI 1640 完全培养液，1.2ml EB 0.4ml环孢素A、0.2mlPHA (第一次转化)
9. 制备冷冻液 95％胎牛血清，5％二甲亚啶，分装，－20℃ 冰箱保存备用。使用时1ml 可用于冻存1 管。
（五）小结
I. 细胞建株时，应分为A 、B 培养两条线。
2. 第一次转化时，培养液的pH值 应为6.8~7.2 。
3. 整个实验过程都需要戴手套。
4. 控制污染， 应用二级无菌操作柜。
5. 必须对所有与转化淋巴细胞和培养液接触的材料进行消毒。
