G418作为一种常见的稳定转染筛选方法，在筛选前应注意以下几点：
1. G418浓度：G418是一种氨基糖苷类似物，通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白的合成。因此，G418的浓度将在筛选过程中进行转染细胞筛选影响很大。筛选前最好优化条件，确定最佳筛选浓度。虽然文献中有报道筛选浓度，但最好亲自确定筛选浓度。
2. 细胞状态：细胞状态会影响药物的敏感性。传统的培养步骤可以保持传染性铺装前的细胞健康。每周传播一到两次，稀释几乎使细胞在下一次传播前融合。不要让细胞融合超过24小时。
3. 细胞维护：根据培养基的颜色和细胞生长情况，定期更换新鲜的培养基。
4. 使用其他抗生素：对于稳定的感染，青霉素和链霉素不应在选择性培养基中使用，因为这些抗生素是G418抗生素的竞争性抑制剂。抗生素不应用于感染培养基，甚至在准备感染前铺设细胞时也应避免使用抗生素。这样，在感染前就没有必要清洗细胞了。
5. 细胞保存：细胞培养在实验室保存数月和数年后会经历突变、总染色体重组或基因调节变化等。如果随着时间的推移发现这种变化，一管保存的新鲜细胞可能会恢复原来的活性。例如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞具有更高的传染效率。进一步传代融化细胞并没有降低转染效率。因此，如果观察到细胞活性降低，可以尝试恢复新鲜培养的细胞，以恢复最佳效果。
一、建立筛选曲线
1. G418的制备:将G4181g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加入蒸馏水至10ml，过滤灭菌，4℃保存；
2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备细胞悬液，按等量接种多孔培养板，培养6h左右开始加药；
3. 制备筛选培养基:在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做1000、400、800、1000ug/ml，筛选培养基由培养基稀释G418制成，按梯度浓度；
4. 加G418筛选：吸收培养基，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度的筛选培养基；
5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5d更换一次筛选培养基；
6. 确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能杀死所有细胞的最小G418浓度为最佳筛选浓度。
二、G418筛选转染克隆步骤：
1. 建立筛选曲线，确定最佳筛选浓度；
2. 细胞铺装：感染后24小时代替壁上的细胞（代替时，注意在显微镜下观察，控制细胞密度，不要使细胞过密，应小于生长表面的50%，参考20%-30%）至15cm培养皿，并添加15~20ml培养基（DMEM，培养含血清；
3. 用最佳筛选浓度的G418筛选细胞:铺板完成后，再24小时表达抗性，用最佳筛选浓度的G418筛选(对于Hela细胞，筛选最终浓度一般为800ug/ml）。具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，浓度为800ug/ml(以Hela为例)培养基15~20ml加入培养皿；
4. 换液:每天观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况及时更换相同浓度(800ug/ml）培养基持续筛选约一周，直到大多数空白对照组(未转染组)细胞死亡(至少30%)；
5. 撤药维持阶段:空白组细胞大部分死亡后，实验组(转染组)换液。此时，G418所用培养基的最终浓度为200ug/ml(维持浓度)，维持生长(如果细胞仍然死亡，需要继续降低药物浓度，参考50-100ug/ml），直到克隆筛选可见(约2~3天)；
6. 分离克隆可以获得最大数量的细胞(增加克隆存活的可能性)，减少单个克隆被其他细胞污染的机会。具体操作如下：a.用PBS清洗含有克隆的培养物，圈出想要分离的克隆。将液体从培养皿中去除，准备24孔板收集克隆；b.用牙签或棉棒(高压后)从培养皿中挑选分离的克隆(具体操作是先用棉棒蘸胰酶，再蘸克隆)；c.在24孔板的孔中剧烈摇动牙签(提前添加完全培养基，不含G418)，使细胞沉入孔中，继续挑选下一个克隆；
7. CO2孵化器，温育细胞约两小时；
8. 两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。如果附着，使用新鲜完整的培养基(含50ug/ml G418)更换24孔板培养基，去除残留胰蛋白酶，继续培养，直至培养物满为止；
9. 一旦少量培养物满，转移到大型培养皿(通常是6孔板)，用50ug/ml的新鲜完整培养基维持培养，然后像其他同类细胞一样处理。
